Böhm u. Oppel aschenbuch der ikroskopischen Technik Achte Auflage ^erlag R* Oldenbourg München u, Berlin OTTO HARRASSOWir; BUCHHANOLUHÖ; TASCHENBUCH der /9/9 Mikroskopischen Technik. Anleitung zur mikroskopischen Untersuchung der Gewebe und Organe der Wirbeltiere und des Menschen unter Berücksichtigung der embryologischen Technik. V on Alexander Böhm und Alhert Oppel. Mit einem Beitrag (Rekonstruktionsmethoden) von Gustav BORN. « ■ — Achte völlig umgearbeitete und erweiterte Auflage von Dr. Benno Romeis Privatdozent in München München und Berlin. Druck und Verlag von R. Oldenbourg. 1919. Alle Rechte, einschließlich des Übersetzungsrechtes, vorbehalten. Copyright 1919 by R. Oldenbourg, Munich. Dem Andenken von Alexander Böhm gewidmet. Vorwort. 4^ o t V Zu Beginn möchte ich vor allem in Dankbarkeit meines verehrten Lehrers Dr. Alexander Boehm gedenken, dessen Erinnerung ich diese 8. Auflage des Taschenbuches widme. Als wenige Jahre nach ihm auch seinen früheren Mitarbeiter, Professor Dr. Oppel, der Tod ereilte, wurde mir der ehrende Auftrag zu Teil, eine Neuauflage des Buches zu übernehmen. Möge es mir geglückt sein, das Werk meines Lehrers in seinem Sinne fortzuführen. Die Fortschritte der mikroskopischen Technik machten eine Erweiterung des Inhalts nötig, wenn anders das Taschenbuch seiner Aufgabe Aufschluß über die wichtig- sten und gebräuchlichsten Methoden zu geben, gerecht werden sollte. Dadurch wie durch das Bestreben die Über- sichtlichkeit des Buches zu steigern, wurde eine eingreifende Umarbeitung nötig. Das Ergebnis dieser Arbeit dürfte schon bei einem Vergleich des Inhaltsverzeichnisses der 7. und 8. Auflage hervortreten. So wurde eine Reihe von Abschnitten wie über die Untersuchung der Piastosomen, des Golgischen Binnenapparates, der Pigmente, der innersekretorischen Organe, ferner über den Nachweis von Fermenten, von anorganischen Substanzen u. a. neu aufgenommen. Andere wie jene über das Mikroskop, die Fixierung, die Einbettungs- und Schneidetechnik, die Färbung, die Untersuchung des lebenden Präparates, der Fette und Lipoide des Blutes, des VI Vorwort. Bindegewebes usw. wurden wesentlich umgeändert und er- weitert. Nur der seinerzeit von G. Born geschriebene Teil über Rekonstruktion blieb, abgesehen von der Einfügung kleinerer Ergänzungen, im wesentlichen unverändert. Der von Oppel der 7. Auflage beigefügte Abschnitt über experimentelle, entwicklungsmechanische Technik konnte leider nicht mehr aufgenommen werden, da er — auf den Stand des heu- tigen Wissens gebracht — den Umfang des Buches zu sehr vergrößert hätte. Den praktischen Gebrauch des Taschenbuches suchte ich durch eine beträchtliche Vergrößerung des Sachregisters zu erleichtern, wofür allerdings eine Verkleinerung der Schrifttypen in Kauf genommen werden muß. Die bereits in früheren Auflagen enthaltene Verdünnungstabelle für Alkohol und eine neuangefertigte Tabelle über die Zu- sammensetzung der gebräuchlichsten Fixierungsflüssigkeiten wurden gesondert beigeheftet, um allenfalls ein Heraus- nehmen und Anschlagen der Tabellen am Arbeitstisch zu ermöglichen. Vielleicht ist es durch diese Verbesserungen geglückt, dem Buche trotz der widrigen Zeitverhältnisse, die auch die starke Preiserhöhung verschuldet haben, seinen bis- herigen Platz zu behaupten. München, im September 1919. Benno Romeis. Inhaltsverzeichnis. Seite AUgemeiner Teil 1—132 1. Kapitel. Das Mikroskop und die optischen Neben- apparate 1 — 10 2. » Die Herstellung' und Untersuchung frischer Präparate 10 — 17 3. » Das lebende Präparat 17 — 22 4. » Fixation für allgemeine Zwecke 22 — 46 a) Allgeraeines über die Fixierung. ... 22 b) Nachbehandlung nach der Fixierung . . 28 c) Zusammenstellung verschiedener Fixie- rungsflüssigkeiten für allgemeine Zwecke 30 5. » Durchtränkung und Einbettung 46 — 62 A. Paraffineinbettung 48 a) Durchtränken mit dem Intermedium 48 b) Übertragen des Objektes in das Paraffin 51 c) Das Einbetten 53 B. Zelloidineinbettung 55 C. Gelatineeinbettimg 59 D. Aufblocken des Objektes 61 6. » Das Mikrotom 62—70 Das Gefriermikrotom 68 7. » Das Aufkleben der Schnitte 70—79 A. Allgemeine Bemerkungen 70 B. Aufkleben von Paraffinschnitten ... 71 a] Methoden mit Wasser 71 ■3) Methoden mit Eiweiß 73 /) Besondere Aufklebemethoden ... 75 C. x\uf kleben der Zelloidinschnitte .... 77 D. Aufkleben der Gefrierschnitte 79 8. » Die Weiterbehandlung aufgeklebter und un- aufgeklebter Schnitte 79—84 2^ ^ n r VIII Inhaltsverzeichnis. Seile A. Paraffinschnitte 79 B. Zelloidinschnitte 82 C. Gefrierschnitte 83 9. Kapitel. Die Färbung 84—113 A. Allgemeines 84 B. Methoden 88 1. Karmin 88 2. HämatoxyHn 90 3. Anihnfarben 97 a) Allgemeines 97 b) Kernfärbung mit basischen Anilin- farben 101 c) Mehrfachfärbung 103 10. » Vitale Färbung 114—118 11. » Das Einschließen der Präparate .... 118 — 123 12. » Rekonstruktionsmethoden von G. Born mit Ergänzungen 123 — 132 Spezieller Teil 133-358 13. Kapitel. Die Untersuchung der Zelle und ihrer Bestandteile 133—164 A. Untersuchung des Zellkernes .... 133 B. Zentrosom und Sphäre, Protoplasma 136 C. Darstellung der Piastosomen (Mito- chondrien, Chondriosomen) 138 1. Fixierungsmethoden 138 2. Bleichung 140 3. Färbungsmethoden TiO D. Die Darstellung des Golgischen Binnen- apparates 143 E. Nachweis von Fett- und Lipoidsub- stanzen 145 1. Neutralfette . 145 2. Fettsäuren 148 3. Cholesterin und Verbindungen des- selben 148 4. Lipoide 149 F. Nachweis von Glykogen 150 G. Nachweis von Fermenten 152 H. Die Untersuchung der Pigmente . . . 155 Allgemeines 155 Melanophoren 158 Allophoren 159 Lipophoren IGü Guanophoren 161 Inhaltsverzeichnis. IX Seite I. Nachweis organischer Substanzen . . 161 a) Eisen 161 b) Kalium 163 c) Calcium 163 14. Kapitel. Epitheüen und Endothellen 165—169 15. » Die Untersuchung des Blutes 170—190 A. Das Ausstrichpräparat 170 1. Die Blutentnahme 170 2. Untersuchung des frischen Präpa- rates 170 a) Rote Blutkörperchen 170 b) Weiße Blutzellen 172 c) Blutplättchen 172 3. Herstellung des Ausstrichpräparates 173 4. Fixierung des Ausstrichpräparates . 174 a) Fixierung des lufttrockenen Aus- striches 174 • b) Fixierung des feuchten Ausstriches 174 5. Die Färbung des Ausstrichpräparates 176 Allgemeine Bemerkungen 176 Spezielle Methoden 177 B. Herstellung von Schittpräparaten . . 182 C. Darstellung von Fibrin 185 D. Verschiedenes (Zählung usw.) .... 187 16. Kapitel. Bindegewebe 190—208 A. Untersuchung des frischen Präparates. 190 1. Koll?tgenes Bindegewebe 190 2. Elastisches Gewebe 192 B. Untersuchung des Bindegewebes mit Hilfe der Verdauungsmethoden. . . 194 C. Färbungsmethoden 197 a) Färbung des kollagenen Gewebes . 197 b) Färbung des elastischen Gewebes . 207 17. Kapitel. Knorpel 209—212 18. » Knochen und Zähne . 212—224 Allgemeine Bemerkungen 212 Entkalkungsflüssigkeiten 213 1. Entkalkung 212 2. Färbemethoden entkalkter Knochen und Zähne 215 S. Die Untersuchung von unentkalkten Knochen und Zähnen 220 19. » Muskelgewebe 224—231 a) Quergestreifte Muskulatur 224 b) Glatte Muskulatur 230 X Inhaltsverzeichnis. Seite 20. Kapitel. Die Untersuchung des iVervensystemes 231 — 273 A. Zentralnervensystem 231 1. Allgemeines 231 2. Untersuchung der Ganglienzelle . . . 232 a) Isolierung 232 b) Kern und Tigroidsubstanz .... 233 c) Darstellung der Piastosomen und Neurosomen 236 d) Darstellung des Golgischen Binnen- apparates 236 e) Darstellung der Ganglienzelle mit ihren Fortsätzen .' . 237 f) Darstellung der Neurofibrillen . . . 241 3. Darstellung der markhaltigen Fasern 249 a) Die Weigertsche Markscheidenfär- bung 249 ß) Modifikationen der Weigertschen Methoden •. . . . 251 y) Weitere Methoden für Markscheiden- färbung 253 4. Darstellung der NeurogUa 257 B. Peripheres Nervensystem 262 Darstellung der Nervenendigungen . . . 266 1. Die vitale Methylenblaufärbung . . . 267 2. Vergoldungsmethoden 271 3. Silberimprägnation 273 21. » Herz, Blut- und Lymphgefäße. Injektions- methoden . . . .* 274—280 Injektionsmethoden 276 22. » Lymphdrüsen, Milz und Knochenmark 280 — 284 23. » Darm und Drüsen 284—295 Darstellung der Schleim- und Eiweißdrüsen 291 Untersuchung des Pankreas 293 24. » Leber 295—298 Darstellung der Gallenwege 296 a) Durch Injektion 296 b) Durch Imprägnation 296 c) Durch Färbung 297 25. » Atmuugsorgane 299 — 300 26. » Niere und Harnwege 301 — 303 27. » Geschlechtsorgane 303—311 1. Weibliche Geschlechtsorgane 373 2. Männliche Geschlechtsorgane .... 300 Inhaltsverzeichnis. XI Seite 28. Kapitel. Innersekretorische Organe 311 — 316 Thyreoidea, Hypophysis 311 Epiphysis 312 Parathyreoidea, Thymus, Keimdrüsen . 313 Nebenniere und chromaffines Gewebe . . 314 29. » Untersuchung Ton Haut, Haaren, Nägeln und sensiblen Nervenendigungen der Haut 316 — 324 Epithelfibrillen 319 Corium und Subkatis 319 Haare 321 30. » Auge 324r— 332 31. » Gehörorgan 333—336 32. » Nase 336—337 32. » Embryologische Technik 837—358 A. Wirbellose 337 B. Wirbeltiere 340 a) Neunaugen 340 b) Fische 341 c) Amphibien 343 d) Reptihen 347 e) Vögel 350 f) Säugetiere 354 Literaturverzeichnis 359 Autorenregister 402 Sachregister 407 Druekfehlerberichtigung 438 TQ» 'C Allgemeiner Teil. 1. Kapitel. Das Mikroskop und die optischen Neben- apparate. 1. Eine ausführliche Beschreibung des Mikroskopes und seiner Nebenapparate liegt außerhalb des Rahmens dieses Buches. Wenn trotzdem in diesem einleitenden Kapitel hierüber einige Bemerkungen folgen, so geschieht dies einerseits, um den Anfänger mit den üblichen Fach- ausdrücken bekannt zu machen und anderseits, um ihn auf die gebräuchlichsten der vorhandenen Hilfsmittel hin- zuweisen. 2. Zur Erzielung schwacher Vergrößerungen bedient man sich der Lupen, insbesondere wenn aufrechte, nicht seitenverkehrte Bilder erzeugt werden sollen, wie es z. B. bei gleichzeitigem Präparieren u. dgl. erwünscht ist. Neben den seit langem bekannten einfachen und zusammen- gesetzten Lupen, welche teils in einfacher Fassung als Handlupen, teils, auf Stativen montiert, als Stativ - lupen benützt werden, sind seit mehreren Jahren zwei vorzügliche neue Konstruktionen von Zeiß in Gebrauch: die binokulare Lupe und die Fernrohrlupe. Die erstere gibt ihrer Konstruktion entsprechend von dem betrach- teten Gegenstand ein plastisches Bild und kommt für 0,75 bis 3 fache Vergrößerung in Frage. Sie kann durch ein Stirn- band vor den Augen befestigt werden, so daß die Hände zum Arbeiten frei bleiben. 3. Bei der Fernrohrlupe wird ein großer Nachteil der einfachen Lupen, nämlich der bei stärkerer Vergrößerung nur sehr geringe Objektabstand beseitigt. (Vergrößerungs- möglichkeit: 0,75 — 20 fach, monokular bis 28,5 fach). Diese Lupe ist in monokularer wie binokularer Kon- struktion in Gebrauch. Die große Brennweite der Fernrohr- lupe (z. B. bei 6facher Vergrößerung 33 cm, bei 20facher noch 10 cm) ermöglicht z. B. auch ein Beobachten lebender Tiere in größeren Aquarien oder ein Betrachten tiefer ge- legener Organe bei Operationen usw. Rom eis, Taschenb. d. mikrosk. Technik. 8. Aufl. 1 2 Mikroskop und Nebenapparate. § 4 — 8. 4. Zur Erzielung stärkerer Vergrößerungen genügen die Lupen [nicht mehr. Dazu dient heutzutage, entgegen dem Brauche früherer Jahi^hunderte, das »zusammen- gesetzte« Mikroskop, das im Gegensatze zum »ein- jfachen« Mikroskop, der Lupe, seitenverkehrte Bilder hefert, so daß also die rechte Seite im Lichtbild links, die obere dagegen unten erscheint. An einem zusammenge- setzten Mikroskop unterscheidet man zwischen Optik und Stativ. Die Stativsäule, welche mittels einer U-förmigen, möglichst stabilen Fußplatte auf dem Mikroskopiertische fest aufstehen muß, trägt, von unten nach oben gezählt: 1. den Spiegel, 2. den Objekttisch und 3. den Tubus. 5. Die eine Seite des drehbaren Spiegels ist meist kon- kav, die andere plan. Die Beleuchtung durch den Hohl- spiegel ist im allgemeinen intensiver als bei Verwendung des Planspiegels. Bei künstlichem Licht arbeitet man bei schwacher Vergrößerung mit dem Planspiegel, bei starker mit dem Hohlspiegel. Ist dagegen zwischen Spiegel und Ob- jekt ein Kondensor eingeschaltet, so benützt man besser den Planspiegel. Nur bei geringer Entfernung der Licht- quelle ist auch hier der Hohlspiegel vorzuziehen. 6. Der Objekttisch, auf den das zu betrachtende Ob- jekt aufgelegt wird, besitzt in der Mitte eine mehr oder weniger große Öffnung, welche durch Blendenvorrichtungen verengert werden kann. Bei den neueren Instrumenten findet man meistens die schon von photographischen Appa- raten her allgemein bekannte Iris blende. Einfachere In- strumente haben dafür vielfach eine Revolver blende, eine exzentrisch zur Objekttischöffnung angebrachte, drehbare Scheibe mit verschieden großen Blendenlöchern. 7. Bei Untersuchung ungefärbter oder fein stuktu- rierter Objekte muß gewöhnlich stark abgeblendet wer- den, um die Einzelheiten scharf hervortreten zu lassen. Bei starker Vergrößerung können unter Umständen zur Abhaltung störender Randstrahlen engere Blenden not- wendig sein wie bei schwacher Vergrößerung. 8. Der Objekttisch kann bei größeren Instrumenten durch zwei seitlich angebrachte Stellschrauben nach allen Richtungen verschoben und dadurch zentriert werden. Um das genaue Verschieben der Präparate zu erleichtern, gibt es auch eigene, auf den Objekttisch aufzusetzende „Kreuztische", deren Gebrauch sehr angenehm ist. Mit Hilfe ihrer Noniuseinteilungen läßt sich jede beliebige Stelle eines Präparates später wieder genau auffinden. Vor Gebrauch muß der Kreuztisch in diesem Falle mit § 9 — 13. Mikroskop und Nebenapparate. 3 Hilfe des jedem Kreuztisch beigegebenen Fadenkreuzob- jektträgers und der seitlichen Objekttischstellschrauben genau zentriert werden. 9. Der Tubus kann bei jedem Mikroskop neuerer Konstruktion durch ein großes zu beiden Seiten der Stativ- säule angebrachtes Triebschraubenpaar gehoben und gesenkt werden. Zur feinen Einstellung dient noch eine besondere Mikrometerschraube an der Seite oder am oberen Ende der Stativsäule. An ihr befindet sich meist eine Meß- trommel, mit deren Hilfe sich die Schnittdicke bestimmen läßt. 10. Am unteren Ende des Tubus wird das Objektiv angebracht. Die mühelose Auswechselung verschiedener Objektive wird entweder durch eine Drehvorrichtung (Objektivrevolver) oder durch eine Schlittenkonstruktion (Objektivschlitten) ermöglicht. Jedes Objektivsystem besteht aus einer Kombination mehrerer Linsen.. Die dem Präparat zugekehrte kleinste Linse heißt Frontlinse. Am oberen Ende des Tubus wird das Okular eingesetzt, eine kurze Röhre, in welche oben und unten Linsen einge- schraubt sind: die obere, dem Auge zugekehrte nennt man die Okularlinse, die untere die Kollektivlinse. 11. Als Achromate werden Objektive bezeichnet, deren sphärische und chromatische Aberration nicht völlig korrigiert ist. Eine Verbesserung stellen die Fluoritsysteme dar. Die beste Korrektion ist bei den dementsprechend auch sehr teuren Apochromaten erreicht, zu denen man am besten auch eigens konstruierte Okulai'e, sog. Kompen- sationsokulare benützt. 12. Die starken Trockensysteme sind auf eine ganz bestimmte Deckglasdicke korrigiert (meist 0,17 mm). Um die Objektive ohne Beeinträchtigung der Bildschärfe auch bei dicken Deckgläsern benützen zu können, werden sie auch in sog. Korrektionsfassungen hergestellt, bei welchen ein Verstellen des Frontlinsenabstandes möglich ist. Auch durch Verstellen des fernrohrartig ausziehbaren Tubus, der Tubuslänge, lassen sich Unterschiede in der Dicke des Deck- glases ausgleichen. 13. Je stärker das Bild im Mikroskop vergrößert wird, desto lichtschwächer wird es. Um diesem Übelstande abzuhelfen, hat man Beleuchtungsapparate konstruiert (Kondensoren, Abbescher Beleuchtungsapparat), welche zwischen Spiegel und Objektivtischunterseite ein- geschaltet werden und für feinere Untersuchungen un- entbehrlich sind. Durch Heben und Senken des Beleuch- 1* 4 Mikroskop und Nebenapparate. § 14 — 16. tungsapparates (meist mittels einer Trieb schraube) läßt sich die Intensität der Beleuchtung je nach Bedarf steigern oder abschwächen. Eine weitere Regulierung läßt sich durch Abbiendung der Randstrahlen mit Hilfe der im Kon- densor angebrachten Irisblende erzielen; die Abbiendung empfiehlt sich insbesondere bei Beobachtung feiner Struk- turen. Will man dagegen nur Farben sehen, z. B. gefärbte Bakterien, und dabei auf die Erkennung etwas oder un- gefärbter Strukturen verzichten, so lasse man das Licht voll einwirken. Das Maximum an Lichtstärke erzielt man da- durch, daß man zwischen Frontlinse des Kondensors und Ob jektträgerunterf lache einen Öltropfen einschaltet (Immer- sionskondensor). 14. Eine weitere Steigerung der Leistungsfähigkeit des Mikroskopes wird dadurch erzielt, daß man zwischen Präparat und Frontlinse des Objektivsystems eine Flüssig- keit sschicht einschaltet, die annähernd das gleiche op- tische Verhalten hat wie Glas. Dadurch wird die Ablenkung der Lichtstrahlen, die bei Anwendung von »Trocken- systemen« durch die zwischen Präparat und Objektiv befindliche Luftschicht eintritt, beinahe völlig ausgeschaltet. Die für diese Zwecke eigens konstruierten Objektive bezeichnet man als „Tauch- oder Immersionslinsen". Für gewöhnlich verwendet man die »homogenen oder Öl- Immersionen«, bei denen eingedicktes Zedernöl als Zwischenflüssigkeit dient (Immersionsöl). Sie sind für alle feineren Untersuchungen unentbehrlich geworden. Auch bei diesen Linsen unterscheidet man je nach dem Grade ihrer Korrektion zwischen Achromaten, Fluorit- systemen und Apochromaten, welch letztere zur Zeit die besten Objektive darstellen. Neuerdings hat Winkel eine billige, achromatische Im- mersionslinse (Hom. Imm. 2,2 mm) in den Handel gebracht, die sich bei etwas geringerer Eigenvergrößerung als die ge- wöhnliche ^/i2 Immersion durch sehr ebenes, großes Gesichts- feld, Lichtstärke und großen Objektabstand auszeichnet. Ebenso Zeiß (Hom. Imm. 1,7 mm). 15. Für spezielle Zwecke (z. B. zur Untersuchung von Präparaten während der Färbung feinster Zellstrukturen) sind auch Immersionssysteme konstruiert worden, bei welchen Wasser als Zwischenflüssigkeit dient (Wasserimmersionen). 16. Eine weitere Steigerung des Auflösungsvermögens wurde in jüngster Zeit durch die mikrophotographischen Apparate für ultraviolettes Licht von Zeiß erreicht, bei wel- chen sämtliche Linsen aus Quarz bestehen, so daß hier auch § 17 — 20. Mikroskop und Nebenapparate. 5 die von gewöhnlichen GlasHnsen absorbierten ultravioletten Strahlen noch ausgenützt werden können, allerdings nicht durch direkte Beobachtung, sondern nur durch Mikrophoto- graphie (vgl. Koehler). 17. Nicht zu verwechseln mit dieser die ultravio- letten Strahlen ausnützenden KoUvStruktion, durch welche formgleiche Bilder erzeugt werden, sind die Apparate, welche zur Untersuchung kleinster ultramikroskopischer Teilchen dienen (Dimkelt'eldbeleiichtung). Bei ihnen ent- stehen nur Diffraktionsbilder, welche über die wahre Ge- stalt der betreffenden Teilchen nur sehr wenig aussagen. Für histologische Untersuchungen ist am besten der Para- boloidkondensor zu verwenden; für Untersuchung von Flüssigkeiten empfiehlt sich der Kardiodkondensor. In einfache]' Weise läßt sich eine Dunkelfeldbeleuchtung durch Einlegen einer sog. Zentralblende in den Blenden- träger eines Abb eschen ßeleuchtungsapparates erzielen. 18. Anweudung'sweise der Dunkelf eldbeleuchtiing. Man gibt auf die Frontlinse des Kondensors einen Tropfen Immer- sionsöl oder etwas (möglichst staubfreies) destilUertes Wasser. Dann schiebt man ihn soweit in die Höhe, bis die Flüssigkeit die Unterfläche des Objektträgers berührt und sich hier in dünner Schicht ausbreitet. Dabei sind Luftblasen unbedingt zu vermeiden. Objektträger und Deckgläser müssen schlieren- frei und peinlichst gereinigt sein, da schon das kleinste Staubkörnchen einen Zerstreuungskreis erzeugt. Sie dürfen eine gewisse Dicke (1,0 — 1,1 mm bzw. 0,1 — 0,17 mm) nicht überschreiten. Zur Dunkelfeldbeleuchtung konnten bisher nur Trockensysteme benützt werden; bei den stärker vergrö- ßernden Objektivsystemen müssen kleine Blendenzylinder eingesetzt werden. Neuerdings bringt Zeiß auch eine aus- gezeichnete Apochromat-lmmersion für Dunkelfeldbeleuchtung in den Handel. Zur Beleuchtung bedarf man einer sehr in- tensiven Lichtquelle (Nernstmikroskopierlampe, kleine Bogen- lampe oder Halbwattlampe), diffuses Tageshcht reicht nicht aus. Bei richtiger Technik bekommt man blendend helle Strukturen auf tiefschwarzem Grunde. (Eingehende Dar- stellungen bei Gebhard 98b, Siedentopf 08, 09 u. a., Gaidukow, Szigmondy u. a.) 19. Die Untersuchung der Doppelbrechung (Aniso- tropie) histologischer Objekte ermöghchen Polarisations- apparate, die aus einem unter dem Objekttisch in den Blendenträger des Kondensors einhängbaren Polarisator und einem am Okular angebrachten Analysator bestehen. 20. Zum Gebrauch stellt man unter möghchster Aus- schaltung von Seitenhcht zunächst beide Nikols parallel, so daß das Gesichtsfeld gleichmäßig hell beleuchtet ist. 6 Mikroskop und Nebenapparate. § 21—23. Sodann dreht man den Analysator um OO'^, wodurch das Ge- sichtsfeld maximal verdunkelt erscheint. Doppelbrechende Elemente leuchten dagegen hell auf. Dreht man jetzt den Objekttisch im Kreise um 360", so wiederholt sich das Auf- leuchten der doppelbrechenden Strukturen viermal. Bleibt das Präparat nach jeder 90 gradigen Drehung dunkel, so ist die Abwesenheit doppelbrechender Substanzen wahrschein- lich. Eine etwaige auf diese Weise schwer erkennbare Doppel- brechung läßt sich durch Einlegen von Glimmer- oder Gips- plättchen in den Polarisator verstärken. Genaueres über die dabei entstehenden Farben der Additions- und Sub- traktionslage usw., ferner über die Fehlerquellen siehe bei Weinschenk, ferner Ambronn. 21. Die hauptsächlich für schwächere Vergrößerungen konstruierten binokularen Mikroskope geben aufrechte, seitenrichtige plastische Bilder. Diese Eigenschaften machen sie besonders für entwicklungs-mechanische, experimentelle und präparatorische Zwecke äußerst empfehlenswert. Braus- Drühner und P. Mayer haben dazu sehr zweckmäßige Stative konstruiert. Um am gewöhnlichen, monokularen Mikroskop eine binokulare, stereoskopische Beobachtung zu ermöglichen, konstruierte Abbe ein stereoskopisches Okular. Von Leitz wird neuerdings ein mit einem Ob- jektiv versehenes binokulares Mikroskop geliefert, das für viele Zwecke (z. B. Beobachtung von lebenden ungefärb- ten Gewebekulturen, von Faserstrukturen usw.) Ausge- zeichnetes leistet, s. darüber Gentzsch-Wetzlar 13. 22. Für mikrospektroskopische Untersuchungen gibt es eigene Spektralokulare. Näheres siehe Enzyklopädie. 23. Die Beleuchtung erfolgt für gewöhnlich am besten durch diffuses Tageslicht, niemals aber durch direktes Sonnenlicht. Durch geeignete Anordnung läßt sich das Tageslicht vollkommen ersetzen, ja für Arbeiten bei star- ker Vergrößerung ist gutes künstliches Licht meist vorzu- ziehen. Ist die Lichtquelle reich an gelben Strahlen, wie z. B. Gasglühlicht oder elektrisches Licht, so schaltet man dieselben durch Einlegen der jedem Mikroskop beigegebenen Blauglasscheibe in den Blendenträger des Kondensors aus. Vielfach verwendet man dazu und zur gleichzeitigen Konzentrierung der Lichtstrahlen auch eine Schuster- kugel, die mit einer Filterflüssigkeit (s. § 24) gefüllt ist. Sehr leistungsfähig sind die Mikroskopierglüh- lampen (Gas oder elektrisch) sowie die Nernstmikrosko- pierlampe von Zeiß, bei welchen die Lichtstrahlen durch eine Schusterkugel oder einen Kondensor gesammelt wer- § 24 — 28. Mikroskop und Nebenapparate. 7 den und zudem alles störende Nebenlicht abgehalten wird. Bei allen punkt- oder strichförmigen Lichtquellen muß eine Mattglasscheibe zwischengeschaltet werden (am besten durch Einlegen in den Blendenträger). 24. Filterflüssigkeiten. a) Kupferoxydammoniakfil- ter: Man fügt zu 40 com Ammoniak 12 Tropfen einer 20% mit etwas Schwefelsäure angesäuerten Kupfersulfatlösung, schüttelt, bis sich der zuerst entstandene Niederschlag völlig gelöst hat, und füllt mit destilliertem Wasser auf 300 ccm auf. b) Achromatisches Lichtfilter für Gasglühlicht: Man löst 0,1 g Anilinblau, wasserlöslich, in 400 ccm destilher- tem Wasser. 4,5 ccm dieser Lösung werden mit 7 ccm einer 20% mit etwas Schwefelsäure angesäuerten Kupfersulfat- lösung gemischt und das ganze mit destilliertem Wasser auf 300 ccm aufgefüllt. Zusatz von etwas Thymol gegen Schimmel. Für elektrisches Licht erhöht man die Menge der Kupfer- sulfatlösung auf 9 ccm und vermindert die Anilinblaulösung auf 3 ccm. 25. Für besondere Zwecke dient die Quarz quecksilber- lampe von Koehler (Zeiß), Bei Vorschalten eines grünen Didymnitratfilters sehen z. B. rotgefärbte Strukturen schwarz aus, was für die Sichtbarmachung feinster Struktur- teile oft wertvoll ist. (Koehler 10). 26. Zur Erleichterung der zeichnerischen Wieder- gabe eines Präparates gibt es verschiedene Zeichenapparate. Der gebräuchhchste dürfte das Abbe sehe Zeichenprisma von Zeiß sein. Das Bild des Präparates wird bei ihm durch zwei Prismen und einen an einem seitlichen Hebelarm angebrachten Spiegel auf die Zeichenfläche geworfen. Dadurch wird es ermöglicht, die Konturen der mikrosko- pischen Bilder bei gleichzeitiger Beobachtung von Prä- parat und Bleistiftspitze mechanisch nachzufahren. Be- leuchtungsunterschiede werden durch Vorschalten von Rauchgläsern ausgeghchen. Die Zeichenfläche befindet sich am besten in Objekttischhöhe. Nicht Normalsichtige müssen ihr Augenglas beim Zeichnen benützen. Sehr bequem ist die Benützung eines verstellbaren Zeichentisches. Der Apparat kann auf jedes Mikroskop aufgesetzt werden. 27. Sehr empfehlenswert, aber teuer und umfangreich ist der von Edinger konstruierte Projektionszeichenapparat, der dank seiner Konstruktion gleichzeitig auch für Mikro- projektion verwendet werden kann. (Hergestellt von Leitz, Winkel und Zeiß.) 28. Zum Messen der Größe der Objekte dienen für gewöhnlich Objektiv- oder Okularmikrometer. Das erstere ist ein Objektträger, auf dem ein Millimeter in 100 Teile 8 Mikroskop und Nebenapparate. § 29—33. geteilt ist. Um die Vergrößerung zu bestimmen, kann man sich eine Anzahl der Intervalle eines Objektmikrometers mit Hilfe eines der genannten Zeichenapparate in Objekt- tischhöhe abzeichnen und diese dann mit Hilfe eines ge- wöhnlichen Maßstabes ausmessen. Zeichnet man dann bei gleicher Linsenkombination, Tubuslänge und Tiscli- höhe die Umrisse eines Präparates, so lassen sich diese mit Hilfe der ermittelten Vergrößerungszahl ebenfalls leicht ausmessen. 29. Beim Okularmikrometer befindet sich das Meß- plättchen im Okular. Man muß hier mittels eines Objekt- mikrometers für jede Vergrößerung zunächst feststellen, wie viele Teilstriche des Okularmikrometers auf ein be- stimmtes Intervall des Objektivmikrometers gehen und kann dann daraus die Vergrößerung errechnen. Am besten ist ein Meßokular mit verstellbarer Okular- linse. Das Meßplättchen wird so eingelegt, daß die Fläche mit der Teilung nach unten sieht. (Nur bei Seibert umge- kehrt.) 30. Eine neue, leicht sichtbare Mikrometerteilung hat Gebhardt (07) angegeben. Sie besteht statt der Teilstriche aus kleinen, schwarzen und roten Quadraten. Benützt man bei der Messung Apochromatobjektive und ein als Meßoku- lar eingerichtetes Kompensationsokular 6, so gleicht ein Intervall des Okularmikrometers bei normaler Tubuslänge (= 160 mm) ungefähr so vielen Mikra (ein Mikron = 0,001 mm), als die Brennweite des benützten Objektives beträgt. Die Brennweite ist jeweils auf der Fassung des betreffenden Ob- jektives angegeben. (Also z. B. bei Apochromat 4 mm ist ein Intervall des Okularmikrometers = 4 /<, bei Apochromat 8 mm = 8^, bei Apochromat 16 mm = 16 /t.) (Wegen wei- terer Angaben über Messung vgl. Enzyklopädie.) 31. Eine Vereinfachung des Messens läßt sich auch mit Hilfe des Stufenmikrometers von Leitz erzielen. Man vgl. dazu auch die von der Firma gegebene Anleitung und Metz 12. 32. Bezüglich Mikrophotographie sei auf die Lehr- bücher und Spezialarbeiten von Neuhauß (07), Kaiserling (10), Gebhardt (97, 98a, 99a u. b), Wychgram (11) u. a., sowie auf die Gebrauchsanleitungen der einzelnen Firmen (besonders von Zeiß, Druckschrift Mikro 320, 264, 233, 279, 272,. 314, 250) verwiesen. 33. Über die Benutzung des Mikroskops. (Anleitung für den Anfänger). a) Man stellt das Mikroskop auf einen feststehenden Tisch, der durch das nahe Fenster gleichmäßiges, helles Licht erhält. Die Stativsäule ist dem Beobachter zugewendet § 33. Mikroskop und Nebenapparate. 9 und bleibt in dieser Stellung stehen. Ein etwa vorhandener Beleuchtungsapparat wird zunächst entfernt. b) An das untere Ende des Tubus bringt man vor- erst das schwächste Objektiv und senkt den Tubus unter seitlicher Beobachtung so weit, bis die Frontlinse des Ob- jektivs etwa 0,5 cm vom Objektivtisch entfernt ist. Dann drehe man den Spiegel so lange hin und her, bis man beim Hineinsehen in den Tubus, in dem zunächst noch kein Okular steckt, ein möghchst helles Lichtbild erblickt. Nun wird das schwächste Okular eingesetzt. Man muß ein völhg gleichmäßig beleuchtetes, helles Gesichtsfeld vor- finden. c) Jetzt legt man den Objektträger derart auf den Objekttisch, daß das Präparat, das für den Anfang mög- lichst groß gewählt wird, in die Mitte des Objekttisch- loches zu hegen kommt (Deckglas nach oben!). Dann blickt man durch das Okular und hebt gleich- zeitig den Tubus durch langsames Zurückschrauben der Triebschraube so weit, bis plötzlich ein deutliches Bild er- scheint, das nunmehr mit Hilfe der Mikrometerschraube scharf eingestellt wird. Von jetzt ab bleibt während des Beobachtens die eine Hand stets an der Mikrometer- schraube. Denn da das Bild stets nur in einer bestimmten Ebene scharf eingestellt ist, der Schnitt aber infolge seiner Dicke zahllose derartige Ebenen besitzt, so muß man bald höher, bald tiefer einstellen, um seine Struktur ganz zu durchmustern. Das geschieht dadurch, daß man während des Sehens die Mikrometerschraube von Zeit zu Zeit um ein geringes nach beiden Richtungen abwechselnd dreht. Die Mikrometerschraube läuft bei längerem Gebrauch, wenn nach einer Seite mehr als nach der anderen gedreht wird, zu Ende und muß dann wieder in eine mittlere Stellung zurückgedreht werden. d) Jede Beobachtung beginne man mit schwacher Vergrößerung. Will man dann ein stärkeres Objektiv einstellen, ist zu beachten, daß der Abstand der Fronthnie vom Deckglas umso geringer ist, je stärker das Objektiv vergrößert. Auch hier dreht man wieder zunächst unter seitlicher Beobachtung den Tubus zunächst nach abwärts, bis die Frontlinse dicht über dem Deckglas steht, sieht dann in das Mikroskop und dreht nun die Schraube vorsichtig und langsam zurück. Ist etwas sichtbar ge- worden, so folgt feine Einstellung mit der Mikrometer- schraube. Das Einstellen mit starkem Objektiv 10 Herstellung frischer Präparate. §33—35. erfordert größte Vorsicht. Dreht man zu tief nach abwärts, so kann Deckgläschen und Präparat, da es sich hier nur um Bruchteile eines Millimeters handelt, sehr leicht zerdrückt werden. Auch eine Beschädigung der Linse ist möglich. e) Hat man das Einstellen genügend geübt, so stu- diere man die Wirkung der Blendvorrichtungen und schließlich des Beleuchtungsapparates. Man ge- wöhne sich von Anfang an, beim Mikroskopieren beide Augen offen zu halten. f) Bei Benützung eines Immersionssystems bringe man auf die zu beobachtende Stelle des Objektträgers einen kleinen Tropfen Immersionsöl und senke nun den Tubus unter seitlicher Beobachtung so lange, bis die Frontlinse in den Öltropfen taucht. Dabei muß das Ent- stehen von Luftblasen vermieden werden. Die weitere Einstellung erfolgt durch Senken des Tubus mittels der Mikrometerschraube unter Beobachtung des Gesichts- feldes. Nach Gebrauch ist Deckglas wie Linse mittels eines mit Chloroform oder Toluol leicht angefeuchteten, sehr weichen Läppchens zu reinigen (Vorsicht, da Chloroform oder Toloul unter Umständen die Verkittung der Linsen zu lösen vermag). Selbstverständlich ist das Mikroskop stets peinlich sauber zu halten. 34. Bemerkung über die Anschaffung eines Mikroskops. Man schaffe sich gegebenenfalls zunächst lieber weniger Objektive an. dafür aber ein gutes, mittleres oder großes Stativ, an dem sich später ein voller Ab bescher Beleuchtungs- apparat und ein Kreuztisch anbringen läßt. Für den Anfang genügt ein schwaches und ein starkes achromatisches Ob- jektiv (z. B. A und E von Zeiß, 3 und 7 von Winkel oder Leitz, II und V von Seibert) sowie ein schwaches und ein stärkeres Okular (z. B. Nr. 1 u. 3). Als Immersion kommt für gewöhnlich die achromatische homogene Immersion V12 in Betracht. Besonders empfohlen sei die nur um geringes teu- erere, sehr leistungsfähige neue Fluoritimmersion von Zeiß. Genaueres über das Mikroskop in den Werken von Am - bronn, Apathy, Dippel, Garten, Petri, Scheffer, A. Zimmermann, ferner in den Arbeiten von Siedentopf {08a u. b, 09, 12, 15). 2. Kapitel. Die Herstellung und Untersuchung frischer Präparate. 35. Als Unterlage für mikroskopische Präparate dienen Objektträger aus Glas von 76:26 mm Seitenlänge §36 — 40. Herstellung frischei Präparate. 11 (sog. englisches Format). Man nehme nur solche aus reinem, weißen, schlierenfreien und nicht zu dicken Glas. Trübe Objektträger weise man zurück. GeschHffene Ränder sind unnötig. 36. Zum Bedecken der Präparate dienen Deckgläs- chen, 0,1 — 0,2 mm dicke Glasplättchen; (bei Benützung von Immersionssystemen wähle man möglichst dünne Deckgläschen!). Eine Größe von 18 — 20qmm ist für gewöhn- lich hinreichend; für große Präparate und Serienschnitte sind entsprechend größere nötig. Bei umfangreichen Serien ist es erhebHch billiger, Deckgläser aus Glimmer (Marien- glas) zu verwenden, doch eignen sich derartig eingedeckte Präparate weniger gut zur Betrachtung mit starken Immer- sionssystemen. 37. Um Objektträger oder Deckgläser vom Hütten- rauch zu reinigen, legt man sie 2 — 3 Tage in konzentrierte Salpetersäure und spült dann sorgfältig mit fließendem Wasser ab. Für gebrauchte Objektträger und Deckgläser, die mit Farbe, Kanadabalsam usw. beschmutzt sind, benützt man die von Zettnow angegebene Flüssigkeit. Man löst dazu 100 g Kaliumbichromat unter Erwärmen in 1000 ccm Wasser und tropft unter Abkühlen und Rühren vorsichtig 100 ccm konzentrierte rohe Schwefelsäure zu. Die zu reinigenden Gläser bleiben 1 — 3 Tage in dieser Flüssigkeit, werden dann mit Wasser abgespült, in verdünnte Natron- oder Kalilauge getauscht und über Nacht in fheßendem Wasser gut ausge- waschen. Sodann legt man sie in 96% Alkohol und trocknet sie vor Gebrauch sorgfältig ab, wobei man es vermeidet, ihre Fläche mit der Fingerbeere zu berühren. 38. Mit Kanadabalsam aufgeklebte Deckgläschen ent- fernt man vorher durch Erwärmen über der Flamme, wobei der Balsam schmilzt und das Deckglas leicht abgezogen werden kann. 39. Aufbewahren. Die gereinigten Objektträger hebt man zur völhgen Entfettung zweckmäßig in einer mit ein- geschhffenem Deckel versehenen Glasdose auf, die mit einer Mischung aus absol. Alkohol, Benzin und Chloroform oder Benzol zu gleichen Teilen gefüllt ist. Kurz vor Gebrauch trocknet man sich eine entsprechende Anzahl von Objekt- trägern mit einem Leintuch ab. 40. Narkose. Stammen die zur Untersuchung kom- menden Präparate von größeren Organismen, so ist es bei schmerzhaften Eingriffen in den weitaus meisten Fällen möghch und angezeigt, die Tiere vor der Entnahme der Teilstücke zu betäuben oder zu töten. Luftatmer narkoti- siert man dazu zweckmäßig mit Chloroform oder Äther, 1:2 Herstellung frischer Präparate. § 41 — 44. indem man die Tiere z. B. mit einem chloroformgetränkten Wattebausch unter eine Glasglocke od. dgl. bringt und das Exzitationsstadium abwartet. Soll das Tier nicht getötet werden, dann nimmt man es gleich nach diesem Stadium wieder heraus und läßt es vorsichtig Äther einatmen, indem man zeitweise über das Maul ein Becher- oder Wasserglas hält, in welchem ein ätherbefeuchteter W^attebausch liegt. Durch vorausgehende Morphiuminjektion (z. B. 1 — 3 ccm einer 2%- Lösung von Morph, hydrochlor. bei einem mittel- großen Hund) läßt sich das Erregungsstadium abschwächen. Wasseratmer bringt man in W^asser, das vorher mit etwas Chloroform odei* Äther geschüttelt wurde. Bei vorsichtiger Dosierung und Benützung von reinem Narkose-Äther oder Chloroform lassen sich auch die kleinsten Tiere ohne nach- folgende Schädigung narkotisieren. Nach beendigter Nar- kose muß man sie natürlich wieder in frische Luft bzw. sauerstoffhaltiges Wasser bringen. 41. Für größere Tiere gibt es entsprechende Operations- bretter. Für kleine Tiere benützt man zweckmäßig mit Wachs ausgegossene Glasschalen, in die dem Körper entsprechende Mulden eingedrückt werden. Zum Festhalten dienen dünne bogenförmige oder gerade Silberdrahtstücke, Glasnadeln od. dgl. (siehe auch Born, Spemann). 42. Kleine Tiere kann man durch rasches Kopf- abschneiden töten unter Zerstörung von Gehirn und Rücken- mark mittels einer Nadel, größere Tiere durch starken Schlag auf den Hinterkopf. Ein humanes Tötungsmittel ist nach Krause (11) Kohlensäure, die aus der Kohlensäurebombe mittels eines Schlauches in eine Glasglocke geleitet wird. Wassertiere kann man auch in einem mit ausgekochtem Wasser vollgefüllten und oben zugedeckten Gefäß durch Er- sticken töten. 43. Mit Curare läßt sich je nach der Dosierung kürzer oder länger dauernde Bewegungslosigkeit erzielen. Man ver- wendet eine 0,5% Lösung in Glyzerinwasser, die man ent- weder dem Tiere injiziert oder, bei Wassertieren dem Wasser zusetzt, 44. Hunde, Kaninchen usw. lassen sich vor der Operation sehr leicht mit einem aus Schwefelkalzium (50,0), kohlen- saurem Kalk (20,0) und Talkum (30,0) bestehendem Pulver enthaaren; man rührt das Pulver mit etwas Wasser zu einem dicken Brei an, feuchtet die Haare mit Wasser gut an und streicht den Brei mit einem Holzspatel auf das Fell. Nach wenigen Minuten lassen sich diese Haare mit dem Spatel einfach wegstreichen. Zu lange Einwirkung greift die Haut an. § 45—50. Herstellung frischer Präparate. 13 Genähte Operationswunden bestreicht man bei Säuge- tieren am besten mit etwas Kollod. elastic. oder mit Masti- 00 1 und klebt etwas Watte oder Kompressenstoff darüber. 45. Mit dem Tode des Tieres ist in vielen Fällen das Leben der einzelnen Zellen noch nicht erloschen. Bringt man dieselben daher in entsprechende Umgebung, so kön- nen sie noch kürzere oder längere Zeit am Leben erhalten werden. Je nach dem Lebenszustand spricht man daher von einem frischen Präparat, einem überlebenden Präparat oder einer Gewebekultur (vgl. Kapitel 2 und 3). 46. Bei der mikroskopischen Untersuchung frischer Präparate ist eine während der Beobachtung eintretende Austrocknung peinlichst zu vermeiden. Dies geschieht durch Zusatz sog. indifferenter Lösungen, die in der Regel den zu untersuchenden Elementen isotonisch sind, ohne daß sie jedoch im strengen Sinne des Wortes indifferent wären. Am besten ist dazu natürlich der dem gleichen Tiere entstammende Gewebesaft. 47. Als weitere indifferente Zusatzflüssigkeiten wer- den Humor aqueus, Amniosflüssigkeit, filtriertes Hühnereiweiß, Blutserum usw. gebraucht. Das letz- tere gewinnt man am besten durch Zentrifugieren von frisch und steril entnommenem Blut. 48. Als Ersatz dieser oft schwierig zu beschaffenden Flüssigkeiten verwendet man verschiedene einfache Lösungen. Am gebräuchlichsten ist die physiologische Kochsalzlösung- deren Salzgehalt je nach der Tierart etwas schwankt, Bei Warmblütern wird .meist 0,9% genommen. Für Sala- mander wird eine 0,8%, beim Frosch eine 0,64% -Lösung empfohlen. 49. Statt Kochsalz kann man auch andere Salze, z. B. . 0,03% Kalziumchloridlösung zur Herstellung isotonischer Lösungen verwenden (Deetjen 04). 50. Für feine Untersuchungen ist die Ringersche Lö- sung (Locke Ol, Kuliabko 02, Michailow 10) vorzu- ziehen. Zusammensetzung: Natriumchlorid (NaCl) 0,9; Kaliumchlorid (KCl) 0,02; Natriumkarbonat (NaHCOg) 0,02; Kalziumchlorid (Ca Gig) 0,02; Aqua dest. 100,0. (Dazu allenfalls noch 0,001—0,25% [Levis] Dextrose.) Die Lö- sung ist nicht sehr lange unverändert haltbar und wird daher am besten frisch hergestellt. Durch Kochen zer- setzt sie sich. 14 Herstellung frischer Präparate. § 51 — 55, Erwähnenswert sind noch folgende Flüssigkeiten: 51. Jodserum nach M. Schultze (64): Amniosflüssigkeit wird bis zur Sättigung mit Jod versetzt; (ein Gewichtsteil Jod löst sich in 7000 Teilen Wasser). 52. Die Kroneckersche Flüssigkeit besteht aus Natrium- chlorid 6,0; Natriumkarbonat 0,06; destilUertes Wasser 1000,0. 53. Während dünne, durchsichtige, flach ausgebreitete Gewebeteile, wie Mesenterium, Omentum mancher Tiere, Knorpelplättchen, Haare, dünne Blutgefäße oder Nerven, abgeschabte Zellen (z. B. Epithelien der Mundhöhle), Sper- matozoon, gewisse Eiarten und ähnliches ohne weitere Zerkleinerung der mikroskopischen Untersuchung unter- worfen werden können, müssen die meisten Organe zu dem Zweck erst zerkleinert werden. 54. Dazu zerschneidet man die betreffenden Organe mit scharfem Messer oder Schere in kleine Stückchen, die dann auf dem Objektträger in einem Tropfen einer indifferenten Flüssigkeit meist mit Hilfe von Zupf- n ad ein weiter zerkleinert werden. Die Nadeln müssen sehr spitz sein und dürfen an ihrer Spitze keinen Widerhaken besitzen. Von Zeit zu Zeit müssen sie auf Sandpapier oder einem Sandstein wieder zugeschliffen werden. Handelt es sich um ein Objekt, welches in der Längsrichtung gefasert werden soll, so setzt man die eine Nadel an einer Stelle des Stückes auf und zerfasert mit der anderen, indem man diese senkrecht zum Faserverlauf des Präparates bewegt. Man nehme beim Zupfen den Flüssigkeits- tropfen nicht zu groß. 55. Einige Gewebe sind so konsistent, daß man von ihnen mit einem Rasiermesser dünne, durchsichtige La- mellen herunterschneiden kann. Sehr weiche Gewebe müssen durch Einlegen in Alkohol, Formol oder Müllersche Lösung gehärtet werden. (Vgl. § 105.) Das Schneiden mit dem Rasiermesser erfordert große Übung, um gute Resul- tate zu geben. Dabei beachte man folgende Punkte: das erste Erforder- nis ist ein gutes, sehr scharfes, schartenfreies Messer. Das Stück, welches geschnitten werden soll, fasse man fest mit Daumen, Zeige- und Mittelfinger der linken Hand und stütze die Hand auf die Tischplatte fest auf. Sind die Präparate klein und schwer zu halten, so klemme man sie zwischen Hollundermark oder in Alkohol gehärtete Leberstückchen; man schneide gegen sich (nicht von sich). Man schneide stets ziehend, nicht drückend, so daß bei jedem Schnitt mögUchst die ganze Schneide des Messers durch das Prä- parat in wagrechter Richtung hindurchgezogen wird. Um § 56—58. Herstellung frischer Präparate. 15 ein Ankleben des Schnittes an der Messerklinge zu verhindern, schneide man feuchte Objekte etwas feucht, d. h. man be- netze vor jedem Schnitt Messerkhnge und Präparatober- fläche mit einer entsprechenden Flüssigkeit. Zuerst lerne man kleine, aber möghchst dünne Schnitte machen, dann erst größere. Die Schnitte spült man durch Eintauchen des Messers in eine entsprechende Flüssigkeit ab. Nach dem Gebrauch wische man das Rasiermesser sorgfältig trocken, um eine Beschädigung von Schneide und PoUtur durch Rost zu ver- meiden. 56. Schleifen und Abziehen des Messers lernt man leichter und besser durch das Sehen. Man benützt zum Abziehen Ölsteine und Streichriemen. Das Abziehen des Messers auf dem Stein erfolgt in der Weise, daß man die Oberfläche des Ölsteines (am besten eines sog. Arkansas- öls t e i n e s) gut mit feinem Knochenöl benetzt und nun das flach aufgelegte Messer ohne Druck mit der Schneide voraus über den ganzen Stein hinzieht, indem man allmählich während eines Zuges die ganze Länge der Messerschneide mit dem Stein in Berührung kommen läßt, zuerst die dem Griff nahe Partie, dann die Spitze. Nun wende man das Messer über den Rücken und verfahre zurück ebenso wie mit der anderen Seite usw. Sodann wischt man das Öl ab und zieht das Messer noch einige- male auf dem Streichriemen ab, nunmehr aber nicht wie beim Stein mit der Schneide, sondern mit dem Rücken voran. Die Streichriemen zeigen meist 4 Abzieh- seiten; die Steinseite ist gewöhnlich unbrauchbar. Die rot- gefärbte Lederseite ist mit grobkörnigem Schmirgel bestrichen, die schwarze mit feinkörnigem, die vierte besteht aus feinem Leder. Man befolge beim Abziehen die genannte Reihenfolge. Von Zeit zu Zeit reinige man die geschmirgelten Lederstreifen, indem man sie mit etwas Butter abreibt und die gereinigte Lederfläche wieder mit einem erbsengroßen Stück der betr. käufhchen Schmirgelmasse, am einfachsten mit Hilfe des Bauches einer glattwandigen runden Arzneiflasche, fest ein- reibt. 57. Für manche Zwecke benützt man zum Schneiden ein sog. Doppelmesser. Dasselbe besteht aus zwei parallel ge- stellten übereinanderhegenden Messerkhngen, deren Schnei- den durch eine Schraube sich mehr oder weniger genähert werden können. Geschnitten wird, indem man mit dem be- netzten Doppelmesser rasch ziehend ein Organ, z. B. frische Leber, durchschneidet. Dasselbe zerfällt in zwei Teile und eine zwischen beiden Klingen befindliche Scheibe. Diese entnimmt man, indem man die Klingen durch Lösen der Schraube (ev. Aufklappen der einen Klinge) unter geeigneter Flüssigkeit voneinander entfernt. 58. Das fertige Zupf- oder Schnittpräparat bedeckt man mit einem Deckglas, wobei man nach Möglich- 16 Herstellung frischer Präparate. § 59 — 6l. keit das Auftreten von Luftblasen vermeiden muß. Dabei ist die Größe der Flüssigkeitstropfen von Wichtigkeit. Ist derselbe zu groß, so werden gerade die feinsten Elemente des Präparates unter dem Deckglas herausgeschwemmt; ist er zu klein, so kommt es zur Bildung von Luftblasen, die sich im mikroskopischen Bild als schwarzumrandete Kugeln und Kreise störend bemerkbar machen. 59. Bei empfindlichen Präparaten bringt man, um eine Zerquetschung derselben durch das aufgelegte Deck- glas zu vermeiden, an den 4 Ecken desselben kleine Wachs- füßchen an, indem man mit jeder Ecke leicht über etwas weiches Wachs streicht. Man kann dazu gewöhnliches Bienenwachs benützen, besser ist sog. Kleb wachs. Her- stellung desselben: Man verrührt geschmolzenes Wachs (2 Gew. -Teile) auf dem Wasserbad mit venetianischem Terpentin (1 Gew.-Teil) und läßt die Mischung erkalten. 60. Bringt man an derartig hergestellten Präparaten an die eine Kante des Deckglases mittels einer fein ausge- zogenen Pipette etwas Flüssigkeit, an die gegenüberliegende Kante aber einen Streifen Filtrierpapier von der Breite des Deckglases, so saugt das Filtrierpapier die unter dem Deckglas befindliche Flüssigkeit ab, wodurch gleichzeitig die an der gegenüberiiegenden Kante neu zugesetzte Flüs- sigkeit nachgezogen wird. Man kann auf diese Weise jede beliebige Flüssigkeit durch das Präparat leiten und den Einfluß derselben auf das beobachtete Objekt stu- dieren. 61. Bei längerer Beobachtung eines frischen oder überlebenden Präparates in einer indifferenten Flüssig- keit ist ein Verdunsten der Zusatzflüssigkeit nach Mög- lichkeit zu vermeiden, da dadurch Konzentrations- änderungen des Mediums eintreten, welche osmotische Störungen hervorrufen. Man kann dies vermeiden durch Herstellung einer sog. feuchten Kammer. Bei kleinen Ob- jekten bedient man sich dazu meist eines hohl geschliffe- nen Objektträgers, an dessen Oberfläche in der Mitte eine mehr oder weniger tiefe Kugelkalotte eingeschliffen ist. Legt man dann über die Aushöhlung ein etwas größeres Deck- glas, an dessen Unterfläche das zu untersuchende Präparat in einem Flüssigkeitstropfen hängt, und dichtet man die Ränder des Deckglases sodann mit Vaseline, Öl, Wachs oder Paraffin ab, so sättigt sich der kleine Hohlraum als- bald soweit mit Feuchtigkeit, daß eine weitere Verdunstung vermieden wird. Beim Auflegen des Deckglases ist zu § 62—66. Das lebende Präparat. i1 vermeiden, daß der Flüssigkeitstropfen den Boden oder die Ränder der feuchten Kammer berührt. 62. Auch durch Auflegen eines kleinen Glasringes auf einen gewöhnlichen Objektträger, Dai^überlegen eines Deckglases und entsprechende Abdichtung läßt sich eine feuchte Kammer herstellen. Bei größerem Rauminhalt ist auf den Boden der Kammer etwas Flüssigkeit zu geben, um eine zu starke Konzentration der Beobachtungs- flüssigkeit infolge Verdunstung zu vermeiden. Eine größere feuchte Kammer kann man sich aus jeder gutschheßenden Glasdose herstellen, auf deren Boden man angefeuchtetes Filtrierpapier oder gutgewaschenen nassen Sand bringt. 3. Kapitel. Das lebende Präparat. 63. Frische Präparate, zu deren Anfertigung und Untersuchung im vorausgehenden Kapitel angeleitet wTirde, sind nicht immer als lebend zu betrachten. Erst die Feststellung von Lebensäußerungen wie z. B. von Assimilation, Selbstbewegung, Selbstteilung und insbesondere von Wachstum berechtigt zu dieser Annahme. Kleine, selbständige Lebewesen, wie Protozoen, kleine Embryonen und Larven usw. lassen sich selbstver- ständlich ohne weiteres in einem geeigneten Medium (ev. in kleinen Gefäßen, Mikroaquarien) unter das Mikroskop bringen und, soweit es ihre Durchsichtigkeit erlaubt, in ihren Lebensäußerungen beobachten. 64. Ferner kann man bei einigen Tieren z. B. beim Frosch in Narkose noch während des Lebens zahl- reiche Organe bzw. Gewebe wie Lunge, Mesenterium, Zunge, Haut, Pigmentgewebe, Nerven u. a. mikroskopisch beobachten; an der ausgebreiteten Harnblase desselben Tieres lassen sich glatte Muskelzellen, Epithelien u. a. betrachten. 65. Beim Kaninchen wurden die Veränderungen der sezernierenden Drüsenzellen des Pankreas (Küh- ne und Lea 74) und der Parotis (Langley 79) längere Zeit bei intakter Blutzirkulation am lebendenTiere mikroskopisch untersucht. 66. Bedeckt man den Nagefalz mit einem Tropfen Kanadabalsam und einem Deckglas, so kann man bei starker auffallender Beleuchtung nach Weiß die Kapillaren und kleineren Hautgefäße beobachten. (Blutstrom, Kon- traktion der Wandgefäße usw.) 18 Das lebende Präparat, § 67 — 71 67. Während bei all diesen Methoden noch eine Verbindung zwischen dem Präparat und dem Tiere selbst besteht, handelt es sich bei eigentlichen Gewebekulturen um Organ- oder Gewebsteile, die außerhalb des Organis- mus und seinem Einfluß entzogen in einem geeigneten Medium am Leben erhalten werden. In strengerem Sinne kann man dabei noch zwischen einem überlebenden Prä- parat und einer eigentlichen Gewebekultur unterscheiden, je nachdem dasselbe eine bloße Fortdauer des Lebens oder aktives Wachstum (Größenzunahme) zeigt. Über die historische Entwicklung siehe Oppel (13, 14). Zusammen- fassende Überblicke über die Technik bei Garrel und Bur- rows 12 und Garrel 12. 68. Bei niedriger Temperatur (etwa 0^ G) lassen sich Organfragmente und Zellen lange Zeit in latentem Lebenszustand erhalten. (Vgl. an neuerer Literatur Wentscher (98 u. 03), P. Ehrlich (06), Michaelis (05), 0. Hertwig und Poll (07), Jolly (10 u. 12). Kann man Organe daher nicht sofort weiterbehandeln, so bewahrt man sie am besten bei niedriger Temperatur auf. 69. Die moderne Technik der Gewebekultur geht in erster Linie auf Harri son zurück, der Gewebeteile des Frosches in steriler Froschlymphe züchtete. Burrows entdeckte dann weiterhin als günstigstes Kulturmedium das Blutplasma. 70. Beim Anlegen von Gewebekulturen ist in erster Linie auf peinlichste Asepsis zu achten. Alle Instrumente, Gläser usw., die beim Anlegen der Kulturen gebraucht werden, müssen keimfrei gemacht werden. Bei nachlässi- gem Arbeiten wird man nur Mißerfolge haben. Vor An- legen einer Kultur durchdenke man das Ganze bis auf den kleinsten Handgriff. 71. Vorbereitung. Die zur Operation des Tieres usw. benötigten Instrumente werden in 1% Sodalösung durch 10 Minuten langes Kochen sterilisiert. Messer lege man in 70 — 90% Alkohol. Tücher, Kompressen usw. werden im Koch sehen Dampf topf sterilisiert, ebenso Glas waren. Die letzteren können auch im Heißluft- sterilisator keimfrei gemacht werden. Legt man Deckglas- kulturen an, so sterilisiert man sich Deckgläser und dazu- gehörige hohlgeschliffene Objektträger in einzelnen Petri- schalen. In einfachster Weise, aber nicht so sicher kann man sie auch dadurch sterilisieren, daß man sie mehrmals durch eine Flamme zieht und abkühlen läßt. §71—75. Das lebende Präparat. 19 72. Gewinnung von Blutplasma. Bei größeren Tieren, z. B. Kaninchen oder Meerschweinchen, legt man in Nar- kose die rechte oder linke art. carotis com. in 1 — 3 cm Länge frei, klemmt dieselbe unten und oben mit je einer weichen Arterienklemme ab. Dann durchtrennt man die Arterie dicht unterhalb der kopfwärts gelegenen Klemme, tupft etwaiges Blut und Gewebesaft sorgfältig ab, faßt das freie Arterienstück an seiner Adventitia mit einer dritten feinen Klemme, so daß man nach Öffnung der unteren, herzwärts gelegenen Klemme den vorschießenden Blutstrahl in be- liebiger Richtung dirigieren kann. Das hervorspritzende Blut fängt man in sterilen, paraffinierten, eisgekühl- ten Zentrifugenröhrchen auf, bedeckt sie dann mit einer Glaskappe und zentrifugiert rasch, am besten in einer gekühlten Zentrifuge. Nach einigen Minuten füllt man das klare, gelbhch gefärbte Blutplasma mit einer sterilen pa- raffinierten Pipette in ebensolche Röhrchen, welche in den Eisschrank gestellt werden. Derartig gewonnenes Blutplasma läßt sich bei vielen Tieren, z. B. Kaninchen, Meerschweinchen, Hasen bis zu mehreren Wochen unge- ronnen aufheben. Bei Berührung des Plasmas mit nicht paraffinierten oder nicht eingeölten Gegenständen oder bei Verunreinigung mit Gewebesaft tritt sofort Gerinnung ein. Manche, wie z. B. Rattenplasma, gerinnen auch bei sorgfältigster Bereitung schon nach einigen Stunden. 73. Durch Zusatz von oxalsaurem Natrium läßt sich die Gerinnung hintanhalten, dasselbe muß vor Anlegen der Kultur durch Calciumchlorid wieder entfernt werden. Diese Methode ist jedoch weniger empfehlenswert. 74. Bei kleineren Tieren, wie z. B. beim Frosch, gewinnt man das Blutplasma am besten in der Weise, daß man unter Narkose mit einem Scherenschlag das Herz freilegt, mit einer eingeölten Injektionsnadel den Ventrikel punktiert und das Blut langsam in eine einge- ölte Rekordspritze saugt. Hierauf läßt man es sorgfältig in ein paraff. Zentrifugenglas ausfließen, zentrifugiert usw. Alles selbstverständlich unter strengster Asepsis. Die Haut läßt sich durch Bestreichen mit einem glühenden Metallspatel oder mit 10% Jodtinktur sterilisieren. 75. Gewinnung von Froschlymphe. Man hängt einen narkotisierten Frosch mit dem Kopf nach unten an den ausgestreckten Hinterbeinen auf. Die Lymphe sammelt sich dann nach einiger Zeit in dem großen Rückenlymph- sack an, den man oben, d. h. in Beckenhöhe durch einen 20 Das lebende Präparat. § 76—80. winkelförmigen Hautschnitt mit der Schere eröffnet. Hebt man sodann den Hautzipfel mit einer Pinzette ab, so kann man mit Leichtigkeit, ohne anzustreifen, eine sterile paraffinierte Pipette einführen und Lymphe herausholen. 76. Zur Gewinnung von Hämolymphe von Schmet- terlingspuppen legt man dieselben kurze Zeit in 90% Alkohol und eröffnet die Leibeshöhle durch einen dorsalen Medianschnitt. (Goldschmidt 16.) 77. Zur Anfertigung der Deckglaskultur selbst zer- legt man das betreffende dem Tiere frisch entnommene Gewebe etwa mit Hilfe einer scharfen Nadel und einem Starmesser in kleinste, nicht über 1 cmm messende Teilchen. Sodann bringt man ein derartiges Teilchen auf ein steriles Deckglas und bedeckt es sofort mit einem Tropfen Blutplas- ma oder Lymphe. Das Medium gerinnt meist sehr rasch. Unterdessen wird das Deckglas umgedreht, mit dem Tropfen nach unten auf einen hohlgeschliffenen Objekt- träger gelegt und durch Vaseline (Schmelzpunkt 46^) oder Paraffin gegen Luftzutritt abgeschlossen. Dieser ganze Vorgang hat sehr rasch zu erfolgen, da das Gewebe gegen Austrocknen sehr empfindlich ist. Es wird daher auch empfohlen, das Zerteilen der Organstückchen in etwas steriler Ringer scher Lösung vorzunehmen. Das Über- tragen der Stückchen erfolgt dann mit Hilfe einer Pipette. 78. Gewebestückchen, welche beim Zerteilen stark ge- quetscht wurden, sterben meist ab. 79. Amgünstigsten wirkt Blutplasma vom gleichen Tier oder der gleichen Tierart (autogenes oder homogenes Blutplasma). Blutplasma einer anderen Tierart (hetero- genes Blut) ruft unter Umständen Wachstumshemmung her- vor. Carrel empfiehlt das Blutplasma zu 14 his ^/^ des Vo- lumens mit destilliertem Wasser zu verdünnen. In anderen Fällen ist Zusatz von Embryonen- oder Muskelextrakt vorteilhaft. Auch andere Extrakte anderer Organe wurden versucht. Dieselben werden meist in der Weise gewonnen, daß die betr. zerquetschten Gewebe mit sterilem destillierten Wasser geschüttelt und auf mehrere Stunden in den Eis- schrank gestellt werden. 80. Das Leben derartiger Gewebekulturen ist beschränkt, da sich einerseits der im Kulturmedium vor- handene Sauerstoff sowie die eigentlichen Nährstoffe er- schöpfen, und anderseits die Zellen des Explantates schädlich wirkende Stoffwechselprodukte abscheiden. Ge- wöhnlich machen sich nach 4 — 8 Tagen Degenerations- prozesse geltend, oft schon früher. Nach 15 Tagen ist das Wachstum meist erloschen. § 81 — 86. Das lebende Präparat. 21 81. Verjüngerung der Kultur. Carrel fand, daß sich das Leben einer Gewebekultur jahrelang verlängern läßt, wenn man die Kultur von Zeit zu Zeit in frisches Nährmedium überträgt. Zu diesem Zwecke wäscht man die Kultur an jedem 3. oder 4. Tag einige Minuten in ste- riler Ringerscher Lösung und fügt dann einen neuen Tropfen des Nährmediums zu. Gegebenenfalls kann man auch Teile der Kultur ausstechen, in Ringerscher Flüssig- keit waschen und in frischem Plasma isoliert weiterzüchten. 82. Auch künstliche Nährboden wurden verschie- dentlich benützt; sie geben jedoch, wenigstens bis jetzt, weniger günstige Resultate als Blutplasma oder Lymphe. Carrel gibt u. a. folgendes Medium an: Na Gl 0,9; CaCl2 0,024; KCl 0,042; Glukose 0,1; Agar 3; destilliertes Wasser 100,0. W. H. und M.R.Lewis benützen Ringer sehe Lösung (s. § 50), der sie bis zu 0,25% Glukose zusetzen, als Kultur- medium. Sie untersuchten auch den Einfluß der einzelnen Komponenten der genannten Lösung auf das Wachstum. Bei Anlegen einer Kultur muß bei nicht gerinnenden, flüssigen Intermedien der Flüssigkeitstropfen mit einer Glasnadel in dünner Schicht über die Mitte des Deckglases ausgebreitet werden. 83. Zur Anlegung größerer Kulturen empfiehlt Carrel Gabritschewski- Schalen, in denen er die Kul- turen zum Teil auf feinen Seidenschleiern anlegt. 84. Um einen Wechsel der Nährflüssigkeit usw. ohne eine Übertragung des Explantates zu ermöglichen, wurden eigene Apparate konstruiert (Burrows 12, Rom- eis 12). 85. Temperatur. Die Kulturen von Kaltblütern werden am besten bei Zimmertemperatur gehalten; Kul- turen von Warmblütern bedürfen einer konstanten Tem- peratur von 37 — 39^ C. Um bei ihrer Untersuchung unter dem Mikroskop eine Abkühlung zu vermeiden, wur- -den verschiedene Vorrichtungen konstruiert. Das Prinzip der einen beruht darauf, daß das ganze Mikroskop in einen mit Armlöchern versehenen Wärmekasten gestellt wird, der mittels eines Thermoregulators auf konstanter Tempe- ratur gehalten wird. Derartige Kästen werden von Zeiß, Lautenschläger, Leitz u. a. geliefert. Bei den anderen Konstruktionen erfolgt die Erwärmung der Präparate durch den mit warmem Wasser oder Elektrizität geheizten Objekttisch. 86. Die Konsistenz des Kulturmediums ist von gro- ßem Einfluß auf die Form der in der Kultur auftretenden 22 Fixation. § 87—89. Zellen (vgl. Uhlenhut 14). Dieselben bedürfen irgendeines festen Substrates, an dessen Oberfläche sie sich ausbreiten können. Als solches dient z. B. die Deckglasfläche, das Fibrin- gerüst oder die Oberfläche des geronnenen Blutplasmas, Seidenfäden usw. 87. Von Interesse ist die Beobachtung Deetjens (06), daß sich die Lebensäußerungen weißer Blutzellen intensiver und längerdauernder erhalten, wenn man Ob- jektträger bzw. Deckgläser aus Bergkristall, Quarz oder Marienglas nimmt. 88. Zur Fixierung von Kulturen können im Prinzip alle später angegebenen Flüssigkeiten verwendet werden. Am einfachsten läßt man die Deckgläser mit der Kultur nach unten auf der Fixierungsflüssigkeit schwimmen. Gute Erfolge, besonders für Übersichtsbilder, gibt Fixierung in Formol (1:4) § 139, nach Bouin § 163, Orth § 132, Carnoy §118: Dauer bei den drei letztgenannten 10 bis 15 Minuten. Bei mehrstündiger Einwirkung leidet bei Orth die Färbbarkeit der Kerne. Bei Orth scher und Zenker scher Flüssigkeit (§ 184) ist es oft gut, die Fixierungsflüssigkeit auf 40 — 50 ^G zu erwärmen. Die Form der Zellen wird auch sehr gut durch kurze Räucherung mit Osmiumsäure- dämpfen (1—2 Min.) fixiert (vgl. auch § 152). Die Kul- turen können in toto gefärbt und montiert werden. Größere Gewebsfragmente sticht man aus und bettet sie nach einem der üblichen Verfahren ein. Bei Fixierung nach Orth oder Zenker wäscht man in Wasser aus und über- trägt die Präparate — wenn nicht Fett oder Lipoidnach- weis beabsichtigt wird — zuerst durch 70% Alkohol in 90% Alkohol, entfernt bei Zenker das Sublimat durch Jod, das Jod durch Natriumthiosulfat (vgl. § 176), wäscht gut in Wasser aus und färbt nun erst mit Hämalaun od. dgl. Die Kerne färben sich auf diese Weise besser. Anilinfär- bungen sind bei Totalpräparaten häufig nicht brauchbar, da sich das Plasma stark mitfärbt. 4. Kapitel. Fixation für allgemeine Zwecke. a) Allgemeines über die Fixierung. 89. Da sich frische Präparate sehr bald nach der Ent- nahme aus dem Organismus hochgradig verändern, so ist es eine Hauptaufgabe der Mikrotechnik, diese postmor- talen Vorgänge hintanzuhalten und die Struktur der Gewebe § 90. Fixation. 23 in einem dem anfänglichen Zustand möglichst getreuen Abbild festzuhalten, zu fixieren. Man bedient sich dazu in den meisten Fällen der Einwirkung gewisser Lösungen, der sog. Fixierungsflüsigkeiten. Bei der Betrachtung fixierter Präparate hat man sich stets vor Augen zu halten, daß keine der bisher bekannten Flüssigkeiten die Struktur der Objekte in dem Zustand zu erhalten vermag, in welchem diese sich während des Lebens befinden, und daß sie daher auch bei bester Methodik immer Kunstprodukte, »Zelleichen«, liefern. Da diese Artefakte jedoch unter gleichen Bedingungen und gleichbleibender Technik immer übereinstimmendes Aus- sehen bieten, so lassen sich aus ihnen trotzdem wertvolle Schlüsse auf den Zustand des lebenden Präparates ziehen, zumal wenn man gleichzeitig durch Vergleich von lebendem und fixiertem Material über den Grad dieser Veränderungen Aufschluß zu gewinnen sucht. Gerade deshalb ist ja auch neben der Untersuchung des fixierten Präparates die des frischen und lebenden von so großer Wichtigkeit. Ist es doch beispielsweise möglich, daß eine im fixierten Prä- parat als körnige oder fädige Struktur sichtbare Substanz in der lebenden Zelle diffus flüssig verteilt ist und erst durch die Einwirkung der Fixierungsflüssigkeit in die ge- nannte Erscheinungsform übergeführt wird. 90. Neben der durch die Fixierung bewirkten Ver- änderung der Struktur hat man ferner die Verän- derungen der Form zu berücksichtigen. Diese bestehen hauptsächlich in einer Schrumpfung, d. h. einer mit Volum- verminderung verbundenen Gestaltsveränderung, welche häufig während der der Fixierung folgenden Nachbehand- lung noch erheblich zunimmt, so daß sie schließlich bis zu 20 — 40% der ursprünglichen Größe betragen kann (s. Tellyesniczky 98, 02; Berg 03, 07, 08). Kaiserling und Germer (93) behaupten auf Grund ihrer Experimente an Blutzellen geradezu, daß alle Reagentien außer der physiologischen Kochsalzlösung schrumpfend wirken. Ver- schiedentlich wurde versucht, die Fixierungsflüssigkeiten durch Zusatz von Salzen oder Zucker den Geweben iso- osmotisch zu machen (vgl. H. Stoeltzner 06, Tob 1er 09, Ho eher 14 u. a.), ein Vorgehen, dessen Zweckmäßigkeit von anderer Seite jedoch bestritten wurde (vgl. Berg 05, Blum 10 u. a.). Den Einfluß der Konzentration der Fixie- rungsflüssigkeit auf die Form feiner Zellstrukturen (Chon- driosomen) untersuchten Bang und Sjövall (16). 24 Fixation. §91. 91. Bei der Fixierung spielt die Fällung der Eiweiß- körper durch die Fixierungsmittel eine wichtige Rolle. A. Fischer(99) hat in vitro die »Fällungskraft« zahlreicher Fixie- rungsmittel an verschiedenen Eiweißkörpern, nämlich 1. an Nukleinsäure (aus Hefe), 2. an Deuteroalbumose und 3. an Serumalbumin untersucht. Die erstere wurde gewählt wegen ihrer engen Beziehungen zum Chromatin, die Albumose könnte vielleicht als Verdauungsprodukt ingewissen Geweben erschei- nen, das Serumalbumin charakterisiert die beiden großen, fixierungstechnisch übereinstimmenden Gruppen der Albu- mine und Globuline, überhaupt die Gerinnselbildner. Nach dem spezifischen Verhalten dieser Eiweißkörper zu den Fi- xierungsmitteln und nach der Löslichkeit oder Unlöslichkeit der Niederschläge in Wasser gruppieren sich die wichtigsten Fixierungsmittel folgendermaßen : I. Nukleinsäure wird nicht oder nur durch starke Konzen- tration gefällt, Deuteroalbumose wird gar nicht, Serumalbumin sowohl aus alkalischen als saueren Lösungen gefällt. Salpetersäure, Essigsäure und damit gesäuerter Alkohol. Unzuverlässige Fällungsmittel, die im Überschuß oft wieder lösen. IL Nukleinsäure wird gar nicht, Deuteroalbumose und Serumalbumin werden nur aus sauren, nicht aus alkalischen (oder neutralen) Lösungen gefällt. Die Niederschläge sind unlöslich. Osmiumsäure, Kaliumbichromat, Altmanns Gemisch, Müllersche Flüssigkeit, molybdänsaures Ammonium. II L Nukleinsäure, Deuteroalbumose und Serumalbumin werden bei jeder Reaktion gefällt. 1. Die Fällung der Nukleinsäure und der Deuteroalbu- mose ist in Wasser leicht löslich; Serumalbumin wird koaguliert. Alkohol, Azeton, Pikrinsäure, Pikrin-Schwefelsäure. 2. Alle Fällungen in Wasser unlöslich. Chromsäure, Sublimat, Platinchlorid, Förmaldebyd, FlemmingscheFlüssigkeit( Chrom-Osmium-Essigsäure) Hermannsche Flüssigkeit (Platinchlorid-Osmium-Es- sigsäure). Hier würden sich noch die meisten Gemische anschließen, z. B. Chrom-Essigsäure, Chrom-Ameisensäure, Chromsäure- Platinchlorid, Sublimat-Essigsäure, kurz alle, die mit Chrom- säure oder Sublimat oder Platinchlorid versetzt sind, wenn auch die andere Komponente zu Gruppe I, II oder III gehört. Eingehend bespricht Fischer (99) auch die Bedeutung des Umstandes, daß Eiweißkörper, welche durch Fixierungsmittel mit geringer Fällungskraft nicht gefällt wurden, bei der Nach- behandlung durch Alkohol gefällt werden können, so daß das schheßliche Resultat oft weniger der angewandten Fixie- 92—95. Fixation. 25 rungsflüssigkeit als der Nachbehandlung mit Alkohol zuzu- schreiben ist. Wenn auch nicht alle Beobachtungen Fischers an Eiweiß- körpern in vitro ohne weiteres auf die lebende Zelle übertragen werden dürfen, so enthalten sie doch das erste methodische Studium der Fixierungsmittel und lehren auf jeden Fall so viel, daß nicht sämtliche in der Zelle nach Ein- wirkung von Fixierungsmitteln sichtbaren Strukturen, ins- besondere jedes Körnchen, auch schon als im Leben vorhanden betrachtet werden müssen. Damit soll jedoch nicht gesagt sein, daß alle Strukturen in fixierten Objekten Kunstpro- dukte, Gerinnungserscheinungen sind; wir können vielmehr behaupten, daß eine große Anzahl von Differenzierungen des Protoplasmas und des Kernes, welche wir direkt im Leben zu beobachten imstande sind (Flemming 82), durch gewisse Fixierungsmittel erhalten werden. A. Fischer hat uns für alle Fälle gezeigt, auf welche Punkte bei der Fixierung der Zellen zunächst zu achten ist. 92. Bisweilen beruht der Wert der Fixierungsmittel (z. B. bei Osmiumsäure oder Formol) unter anderem darin, daß sie selbst w^enig fällungsfähig sind, die Zellsubstanz aber so verändern, daß die Entstehung sonst bei der Nach- behandlung mit Alkohol auftretender Artefakte ausbleibt (Mönckeberg und Bethe 99, O. Schultze 10b). 93. Eine lehrreiche Zusammenstellung der zahlreichen, bei der Fixierung in Betracht zu ziehenden Faktoren gab jüngst Schaffer (18) mit Hinweisen auf die darüber vorlie- gende Literatur (vgl. ferner auch Apathy 10). 94. Man fixiere womöglich immer in lebensMschem Zustand, da sich die Organe nach dem Tode sehr rasch verändern; so haben Policard und Garnier schon 15 Mi- nuten nach dem Tode relativ große Veränderungen an der Niere beobachtet. Die rasche Veränderlichkeit von Magen und Pankreas ist allgemein bekannt. Über die Verände- rung faulender Organe siehe Falk (67). Material, das man nicht sofort fixieren kann, hebt man am besten bei niederer Temperatur (im Eisschrank) auf (s. auch § 909). 95. Von großer Bedeutung ist das Difi'usions ver- mögen der Fixierungsflüssigkeit, das aber auch von der Beschaffenheit des zu fixierenden Organes abhängt und sogar bei ein und derselben Organart je nach dem je- weiligen Funktionszustand usw^ wechseln kann. Dringt eine Fixierungsflüssigkeit nur langsam ein, so dürfen die in sie eingelegten Stücke nur geringe Dicke besitzen, da sich sonst die im Innern gelegenen Zellelemente vor ihrer Fixierung mehr oder weniger stark verändern können. Ist die Dicke eines Stückes eine geringe, wie z. B. bei dünnen 26 Fixation. § 96—100. Membranen, so ist Länge und Breite unwesentlich. Die Stückgröße von Organscheiben kann demnach eine be- hebige sein, wenn die kleinste Seite des Stückes die im folgenden bei den einzelnen Flüssigkeiten meist angegebene Maximalgröße nicht überschreitet. Um die Einwirkung der Fixierungsflüssigkeit von allen Seiten zu ermöglichen, ist es gut, den Boden der Gefäße vor dem Einlegen der Organe mit Glaswolle, Filtrierpapier oder Watte zu be- decken oder die Organe in der Flüssigkeit in Körbchen (Schaffer 99b) od. dgl. aufzuhängen. 96. Die Dauer der Fixierung ändert sich je nach Zu- sammensetzung der Flüssigkeit und der Beschaffenheit des Objektes sowie dem beabsichtigten Zwecke. Häufig dringt die Fixierungsflüssigkeit verhältnismäßig langsam ein, weshalb man die Stücke nicht zu bald aus der Flüssig- keit nehmen darf; anderseits darf sich aber die Einwirkung auch nicht auf unbegrenzte Zeiten ausdehnen, da die Prä- parate in vielen Flüssigkeiten mit der Zeit brüchig und schlecht färbbar werden, mazerieren, schrumpfen oder quellen. Im nachfolgenden sind bei den einzelnen Flüssigkeiten meist die Zeiten kürzester Einwirkung für kleine (3 — 5 cmm messende) Stückchen angegeben. Größere Stücke sind entsprechend länger zu behandeln. 97. In vielen Fällen zeigen die Randpartien eines Objektes ein anderes Fixierungsbild wie die zentral gelegenen, was sich insbesondere an den feineren Zellstruk- turen bemerkbar macht. Die periphere Fixierungszone ist meist die dem lebenden Zustand entsprechendere, was bei zytologischen Untersuchungen zu beachten ist. 98. Durch einseitiges Eindringen der Fixierungs- flüssigkeit kann eine Verlagerung von Protoplasma- und Kerninhalt nach einer Seite hervorgerufen werden (T e 1 1 y e s - niszky, ferner Schaffer 18 u. a.). 99. Einfluß der Temperatur. Um die Diffusion der Fixierungsflüssigkeit zu beschleunigen, wird viel- fach vorgeschlagen , die Fixierung zumal während der ersten halben Stunde bei erhöhter Temperatur, gewöhn- Uch bei 37 — 40^ C im Thermostaten vorzunehmen. Schu- berg (10) bringt die Organe in die zum Kochen erhitzte Fixierungsflüssigkeit, die er dann kurze Zeit darauf durch Nachschütten von bereitgestellter kalter Lösung rasch wieder abkühlt. 100. P Olicard (1913) empfiehlt dagegen bei nied- riger Temperatur, am besten im Eisschrank bei ^ 0^ § 101—103. Fixation. 27 bis -f 6° G zu fixieren. Er fand bei seinen vergleichenden Versuchen, daß dabei die Struktur auch bei größeren Organstücken erhebUch besser erhalten bleibt als bei Fi- xation in warmer Flüssigkeit, was zum großen Teil auf dem Stillstand autolytischer Prozesse beruht. Die durch die Abkühlung bewirkte Verminderung der Diffusionsgeschwin- digkeit kommt demgegenüber praktisch nicht in Betracht. Ich kann die Richtigkeit der Angaben Policards an eige- nen Versuchen bestätigen. 101. Fixation durch Injektion. Zur Fixierung großer Organe und ganzer Tiere injiziert man am besten die Fixie- rungsflüssigkeit durch die Blutgefäße. Man bindet dazu nach Kolmer (12) eine Kanüle in den zentralen Stumpf der vena jugularis eines tief narkotisierten Tieres ein und durchspült den Blutkreislauf zunächst mit körperwarmer Ringerlösung, wobei man durch leichtes Massie- ren die Zirkulation in den Gefäßen des nicht angebundenen Tieres fördert. Sobald die Flüssigkeit aus dem peripheren Jugularisstumpf klar abfließt und das Herz stillsteht, öffnet man rasch die Brusthöhle, steckt in die linke Herzkammer eine Kanüle und läßt nun die gewünschte Fixierungsflüssigkeit einlaufen, wobei man den Druck für 30 — 40 Sekunden dem Blutdruck des Tieres entsprechend (nicht stärker!) erhöht. Zur Vermeidung von Gefäßverengerung ist es wichtig, daß die Fixierungsflüssigkeit möglichst unvermittelt die Salz- lösung in den Blutgefäßen ersetzt, 10 Minuten später öffnet man die Körperhöhlen und legt das ganze Objekt noch in die Fixierungsflüssigkeit. Die Injektion muß unter Vermei- dung von Luftblasen vor sich gehen. Bei kleinen Tieren führt man die Kanüle gleich in den linken Ventrikel ein und macht in den rechten einen Einschnitt. Besonders geeignete Fixie- rungsflüssigkeiten sind: Müller-Formol (§ 132), Zenker- Formol (175) oder nach Held: gesättigte Lösung von Kalium- bichromat 2 (4) Teile, 10%iges Formol 2 (4) Teile, Eisessig 1 Teil oder gesättigte Lösung von Kaliumbichromat 2 Teile, 10%iges Formol 2 Teile, gesättigte Lösung von SubUmat 2 Teile, Eisessig 1 Teil. Nach der Fixierung 12 — 24 stündige Nachbehandlung in 5%iger wässeriger Lösung von Lithium sulfuric. Dann gründliches Auswaschen mit Wasser. Der Er- folg dieser Methode ist bei richtiger Technik sehr gut. (Siehe auch Mann (94) Kolmer (12) u. a.). Wiesner (12) be- schreibt einen zur Durchspülung sehr geeigneten Apparat. 102. Bei sublimathaltigen Flüssigkeiten sind Spritzen und Kanülen mit Metallteilen zu vermeiden. 103. Das Volumen der fixierenden Flüssigkeit darf nicht zu klein sein, sondern soll die Stückgröße für gewöhn' lieh mindestens um das 50- bis 100 fache übertreffen. 28 Fixation. § 104—107. 104. Es gibt keine Fixierungsflüssigkeit, durch die sich alle Zell- und Gewebebestandteile gleichgut erhalten ließen. Daher ist es bei eingehenden Untersuchungen immer notwendig, mit mehreren Flüssigkeiten zu arbeiten. Wenn eine Flüssigkeit das eine Organ gut fixiert, so ist damit noch nicht gesagt, daß sie deshalb auch bei einem anderen den gleichen Erfolg gibt. Die Fixierbarkeit kann sich je nach dem physiologischen Zustand der einzelnen Zellen sogar bei den Zellen ein und desselben Gewebes innerhalb eines Tieres verschieden verhalten (vgl. auch Apathy 10). Jede Flüssigkeit gibt wieder andere Resul- tate. Nach Apathy ist keine Fixierung beendet, ehe das Objekt in 96% Alkohol gebracht wurde. 105. Die Fixierung bewirkt in vielen Fällen auch eine Härtung des Gewebes, ein Vorgang, der jedoch nur dann von Bedeutung ist, wenn uneingebettetes Material mit dem Rasiermesser geschnitten werden soll (s. auch § 55). b) Nachbehandlung nach der Fixierung. 106. Mit der Fixierung ist die Behandlung des Prä- parates noch nicht beendet, da dasselbe nur in den wenig- sten Fällen ohne Schaden in der Fixierungsflüssigkeit gleichzeitig auch aufgehoben werden kann. Meistens muß vielmehr hernach der Überschuß der Fixierungsflüssigkeit wieder aus dem Präparat entfernt, ausgewaschen werden. Je nach der Fixierung und der dabei verfolgten Absicht ist die Art der Nachbehandlung verschieden. Das Aus- waschen erfolgt meist durch Wasser oder Alkohol. In manchen Fällen geht dem Auswaschen noch eine Impräg- nierung mit irgendwelchen Metallsalzen, eine »Beizung« voran. Nach dem Auswaschen müssen die Präparate meistens entwässert werden, was durch Übertragen in wasser- freien Alkohol erfolgt. Um dabei aber starke Zerreissungen und Schrumpfungen zu vermeiden, erfolgt dies schritt- weise, indem man die Präparate aus Wasser zunächst in schwachprozentigem Alkohol (50 — 70%) und dann allmäh- lich in höherprozentigen überträgt. Welche Methode im einzelnen bei den verschiedenen Fixierungsflüssigkeiten ein- geschlagen werden soll, wird bei den einzelnen Flüssig- keiten angegeben. 107. Tabelle I zeigt an, wieviel Kubikzentimeter destillier- ten Wassers man zu 100 com Alkohol von bestimmtem Prozent- gehalt hinzuzufügen hat, um einen schwächeren zu erhalten. § 108—109. Fixation. 29 Zur Bestimmung des Prozentgehaltes kleiner Alkoholmengen ist das nach Plates Angaben von Erich Koellner in Jena hergestellte Alkoholometerbesteck sehr zu empfehlen. Sehr einfach ist folgende auch zur Verdünnung anderer Lösungen geeignete Methode: Soll aus einer Lösung von a^o eine solche von ö^Iq hergestellt werden, so nimmt man b Teile der a^/olgen Lösung, [a—b) Teile des Lösungsmittels und er- hält a Teile der gewünschten b^/oigen Verdünnung. Z. B. aus Qß^igem Alkohol soll 70^/niger hergestellt werden. Man nimmt 70 Teile des 96«/oigen Alkohols, fügt (96—70) = 26 Teile Wasser hinzu und erhält 96 Teile 70Voigen Alkohols. Soll ferner aus einer Lösung (1:a), eine solche i:b hergestellt werden, dann nimmt man a Teile der Lösung (l:a), fügt {b — a) Teile des Lösungsmittels dazu und erhält dann b Teile der Verdünnung (1: &), z. B. Formahn (1:3) soll auf 1:20 verdünnt werden. 3 Teile von (1:3) werden mit 17 Teilen Wasser verdünnt = 20 Teile. 1:20. (Rieckenberg.) Den gebrauchten Alkohol sammelt man, um ihn dann am besten aus einem Kupferkessel (im Glaskolben stößt er leicht stark) abzudestilheren. Als erstes Destillat bekommt man gewöhnlich einen 85 — 95% Alkohol. Diesen schüttelt man mit gebranntem Kalk gut durch und destilliert am nächsten Tag über dem CaO ab, worauf man reinen, völlig wasserfreien Alkohol erhält. 108. Zur Erleichterung des Auswaschens mit fließendem Wasser wurden zahlreiche Apparate angegeben. Einfach und bequem ist es, die Präparate in eine Spritzflasche von etwas dickerem Glas wie gewöhnlich zubringen, und deren kurze Röhre mittels Gummischlauch an die Wasserleitung anzuschließen. Um ein Fortschwimmen kleiner Präparate zu verhindern, bindet man über die Öffnung des langen Rohres etwas Gaze. Die Ausflußöffnung ist nicht zu fein zu nehmen. Empfehlenswert sind auch kleine, beiderseits offene Glas- zylinder, welche mit feiner Gaze zugebunden und an einer Schnur in fheßendes Wasser gehängt werden. Das Zubinden mit Gaze erspart man sich bei Verwendung der St ei nach- sehen Siebdosen (87), der Schafferschen Netzkörb- - chen (99b) oder der Fairchildschen Porzellansiebe (96), welch letztere durch einen großen Korkstopsel schwim- mend erhalten werden können. Thoma (94) konstruierte eine rotierende Trommel. Ich selbst benütze seit einigen Jahren mit gutem Erfolg einen von mir angegebenen Glas- apparat, dessen Handhabung sehr einfach ist (Romeis 14). 109. Um das Spritzen des Wasserhahnes und das beson- ders nervösen Leuten lästige Geräusch des fließenden Wassers zu vermeiden, empfiehlt Schuberg (10) in den Wasserhahn einen weit durchbohrten Kork zustecken, durch dessen Boh- rung ein Bindfaden bis auf den Wasserspiegel herunterhängt. 30 Fixation. § 110—113. 110. Das Übertragen kleiner Objekte aus einer Flüssig- keit in eine andere erfolgt zweckmäßig mit einer Pipette oder dem Bornschen Siebspatel. c) Zusammensetzung verschiedener Fixierungsflüssigkeiten für allgemeine Zwecke. 111. Eine Reihe von Flüssigkeiten wird nur für ganz spezielle Zwecke verwendet, wie z. B. für den Nachweis von Glykogen, gewissen Lipoiden usw., andere werden dagegen mehr oder weniger für alle Organe benützt, wobei sie, wenn sie auch nicht überall Gleichgutes leisten, doch einen allgemeinen Überblick gestatten. Die gebräuch- lichsten Fixierungsflüssigkeiten letzterer Art sollen nach- folgend, in alphabetischer Reihenfolge nach ihrem jeweiügen Hauptkonstituens geordnet, zusammengestellt werden. (Vgl. auch noch die Tabelle II am Ende des Buches.) Aceton. 112. Man fixiert kleine Stückchen (ca. 3 cmm oder kleiner) % — 1 Stunde lang und überträgt dann durch Xylol oder auch direkt in Paraffin. Wegen der Kürze des Verfah- rens kommt es hauptsächlich für Schnelldiagnosen in Be- tracht. Im allgemeinen fixiert es schlecht und wirkt stark schrumpfend. (Neuere Literatur: Brunk 05, Henke und Zeller 05, Sitsen 05, Neumayer 09, Anitschkow 07.) (Über besser fixierende Mischungen siehe Sand (10) §1040 und Szent Györgyi (14) §1345.) Alkohol. 113. Wird zur Fixierung kleiner Stücke am besten als absoluter Alkohol angewendet. Fixierungsdauer: bei sehr kleinen Stückchen (1 — 3 mm) genügen 1 — 3 Stunden, bei größeren entsprechend länger. Bedingung für gute Fixierung ist, daß man die Präparate auf dicker Watte- schicht in große Mengen von abs. Alkohol bringt. Fette und fettartige Substanzen gehen bei Alkoholfixierung natürlich in Lösung. Dagegen werden andere wie z. B. Glykogen sehr gut erhalten. Zur Fixierung sehr wasser- haltiger Organe nimmt man wegen der starken Schrump- fungen statt abs. Alkohol besser das Carnoysche Gemisch (§118). Große Präparate können mit absolutem Alkohol in toto nicht fixiert werden. Man verwendet dazu besser § 114—119. Fixation. 31 30 — 40% igen Alkohol. Nach 24 Stunden muß man, um Mazerationen zu vermeiden, in steigendem Alkohol weiter- behandeln. Für mikroskopische Untersuchung ist aber diese letztere Art der Fixierung nicht brauchbar. 114. Nach Fischer (99) wird der Alkohol infolge seiner großen allseitigen Fällungskraft und der Koaguherung der meisten Eiweißkörper wohl geeignet sein, dauerhafte Nieder- schläge zu bilden, während er anderseits vollkommen un- tauglich ist, aus Albumosen und Nukleinsäure bestehende, im Leben noch ganz oder halb gelöste Bestandteile der Zelle in den Präparaten zu erhalten. 115. Bei der Alkoholfixierung (wie auch bei \ielen anderen) kann es besonders in den Randteilen des Präparates in- folge der Diffusionsströme zu einer Verlagerung von Zell- und Kerninhalt, ja sogar von den Kernen selbst kommen [»Flucht des Inhaltes der Zelle gegen den Mittelpunkt des Stückes« Tellyesniczky (98), neuerdings Schaffer 18]). Ich sah diese Erscheinung aber auch oft ausbleiben. 116. Der Alkohol empfiehlt sich als chemisch-inaktives Fixierungsmittel besonders für Fälle, in denen es sich um Lösung chemisch-analytischer Fragen handelt, da durch ihn die chemische Konstitution der Proteide am wenigsten stö- rend beeinflußt wird (also z. B. für Prüfung der Chromo- phihe u.a.). Stauffacher (14) hält den Alkohol auch für ein gutes Erhaltungsmittel der Struktur, sofern man ihn in einer dem betreffenden Gewebe angepaßten Konzentration verwendet. 117. Absoluter Alkohol mit Zusatz von Eisessig (z. B. 20 ccm auf 100 ccm Alkohol) dringt rasch ein und fixiert, nicht über ein paar Stunden angewandt, vielfach gut. Nach der Fixierung überträgt man direkt in reinen, absoluten Alkohol. Dann Einbettung. 118. Noch besser ist besonders für Kernstrukturen die Carnoysche Flüssigkeit (auch als van Gehuchtens Ge- mischbezeichnet), welche aus 60 ccm absolutem Alkohol, 30 ccm Chloroform und 10 ccm Eisessig besteht. Die Lösung dringt sehr rasch eim Kleine Objekte fixiere man nicht über y2 — 1 Stunde, selbst größere sind in 2 — 3 Stun- den fixiert. Bei zu langer Einwirkung entstehen Schrump- fungen. Außerdem werden die Präparate sehr hart. Nach der Fixierung übertrage man gleich in absolutem Alkohol. 119. In Alkohol-Formalin, 2Teile 80% — absoluten Alkohol und 1 Teil käufliches Formalin (Schaffer 08 u. 18), wird 1 — 2 Tage fixiert, größere Stücke länger. Sodann überträgt man in entsprechenden reinen Alkohol. Nimmt man 80% Alkohol, so bewahren bei rascher Weiter- 32 Fixation. § 120—125. behandlung auch sehr dotterreiche Embryonen nach meinen Erfahrungen gute Schneidefähigkeit. 120. Nach Reimann und Unna (12) soll ein Zusatz von 2% Chlorzink zum 96% Alkohol (besonders für Proto- plasmadarstellung) gute Resultate geben. 121. Rudnev (07) legt frische Organe in eine dünne Alkohol-Äther-Celloidinlösung (vgl. § 232 2% Lösung) und beläßt sie darin längere Zeit (bis zu Wochen). Die Mischung fixiert, wird dabei dicker und kann gleich zum Einbetten verwendet werden (vgl. Celloidindurchtränkung). Chromsäiire und Chromsalze. 122. Chromsäure allein wird zur Fixierung in % ^is %% wässeriger Lösung angewandt. Kleine Stücke fixiere man nur einige Stunden, größere dagegen mehrere Tage bis Wochen, wobei man die Flüssigkeit, die minde- stens das 200 fache an Volumen betragen soll, mehrmals erneuert. Nach der Fixierung wird in fließendem Wasser gut ausgewaschen, bis die gelbe Farbe der Stücke möglichst verschwindet. Die Chromsäure geht bei der Fixierung nach von Tappeiner (90) mit Eiweiß und Leim schwer- lösliche Verbindungen ein. 123. Ohne Zusatz wird die Chromsäure nur mehr selten angewandt, da sie das Protoplasma schlecht fixiert; etwas besser erhält sie das Kernchromatin. Sehr starke und sehr verdünnte Konzentrationen zerstören den Kerninhalt. 124. Chromessigsäure, d. h. eine 0,5% Chromsäure mit 5% Eisessigzusatz fixiert besser als Ghromsäure. 125. Das wichtigste Chromsäuregemisch ist die Chrom- Osmium-Essigsäure von Flemming (82 u. 95a). Das sog. starke Gemisch besteht aus: Chromsäure 1% 15,0; Osmiumsäure 2% 4,0; Eisessig 1,0. Man halte sich die einzelnen Lösungen getrennt vorrätig und vereinige sie erst kurz vor Gebrauch. Da die Flüssigkeit nur langsam in das Gewebe eindringt, so dürfen in ihr nur kleine Stücke fixiert werden (nicht über 2 — 3 mm Seite, besser kleiner). Man läßt die Flüssigkeit, bei der das 5 fache Volumen der Stückgröße ausreicht, wenig- stens 24 Stunden einwirken, besser länger, selbst wochen- lang; doch werden sehr zarte Objekte durch zu lange Ein- wirkung schließlich sehr brüchig. Nach der Fixierung wird 24 Stunden lang in fließendem Wasser ausgewaschen; dann übertragen in 70%, 80% und 90% Alkohol usw. Die Flemmingsche Lösung ist für kleine Stücke eine der besten Fixierungsflüssigkeiten. Sie fixiert Kern \ui(l §126-131. Fixation. 33 Protoplasma gleichgut, auch die feinsten Strukturen. Ge- färbt wird am besten mit Safranin, Gentianaviolett oder Eisenhämatoxylin. Siehe darüber § 358, ferner auch § 528. 126. Außer dem starken Gemisch hat Flemming noch ein schwaches Gemisch angegeben, das man aus folgenden Lösungen zusammensetzt: Chromsäure 1% 25,0; Osmium- säure 2% 5,0; Essigsäure 1% 10,0; Aqu. dest. 60,0. Fixie- rungsdauer 24 Stunden-Wochen; Nachbehandlung wie bei §125. 127. Folsches Gemisch. Chromsäure 1% 25,0; Osmium- säure 1% 1,0; Essigsäure 2% 5,0; Aqu. dest. 68,0. Anwendung wie bei Flemming scher Lösung. 128. Sehr häufig kommt das saure chromsaure Kali (Synonyme: doppeltchromsaures Kali, Kaliumbi- chromat, dichromsaures Kali) als Fixierungsmittel, hauptsächlich in Gemischen, zur Anwendung. Braucht man es für sich allein, was nicht empfehlensw^ert ist, so wird es ansteigend in 2 — 5% Lösung gebraucht, d. h. die Stücke kommen zuerst in 2%, dann in 3%, 4%, 5% Lösung. Die Form der Zellen wird zwar nicht schlecht konserviert, die Kerne werden dagegen meist homogen. 129. Nach Burchardt (97) sind die Chromsalze des Kahums, Natriums, Lithiums u. a. kernzerstörend, während die Bichromate von Calcium, Barium und Cuprum die Chro- matinstruktur erhalten. Daher folgende Mischungen, welche die Zellstruktur im allgemeinen gut fixieren: a) Calc. bichr. 4% 60,0 Kai. bichr. 5% 30,0 Eisessig 5,0 b) Barium bichr. 4% 60,0 Kai. bichr. 5 °^o 30,0 Eisessig 5,0 c) Cupr. bichr. 6% 60,0 Kai. bichr. 5% 30,0 Eisessig 5,0 Fixierungsdauer 6 — 24 Stunden; hierauf gründhch wässern. 130. Sehr verbreitet war früher die MüUersche Flüssig- keit, die aus 2,0— 2,5 g Kai. bichrom. und lg Natr. sulfuric. auf 100 ccm Wasser besteht. Nicht allzu große Stücke werden hierin längere Zeit im Dunkeln fixiert. An- fangs wird die Flüssigkeit tägUch gewechselt, später wöchent- lich 2 mal; mitteldicke Objekte wie z. B. Rückenmark des Menschen brauchen mindestens 6 — 8 Wochen zur Durch- fixierung. Fixierungsresultate wie bei Kaliumbichromat allein. BeträchtHch kürzere Zeit bei ziemHch gleichen Resultaten beansprucht die Erlickische Flüssigkeit. 131. Erlickische Flüssigkeit. (Kahum bichrom. 2,5 g; Cupr. sulfuric. 0,5 g; Aqu. dest. 100,0). Man wechselt die Romeis, Taschenb. d. mikrosk. Technik. 8. Aufl. 3 34 Fixation. § 132—136. Flüssigkeit alle 2 Tage. Die Fixierung erfolgt in 3 — 4 mal kürzerer Zeit als bei der Müllerschen. Um die nach der Fixierung oft auftretenden - Niederschläge zu beseitigen, empfiehlt Löwenthal, die Präparate vor der Behandlung mit Alkohol in 0,5% Chromsäure, in warmes Wasser oder in etwas mit Salzsäure angesäuertes Wasser zu legen. 132. Orths Gemisch besteht aus 9 Teilen Müllerscher Flüssigkeit zu der unmittelbar vor Gebrauch 1 Teil For- mol gesetzt w^ird. Fixierungsdauer 24 — 48 Stunden im Dunkeln. 24 stündiges Auswaschen in fließendem Wasser. Die Resultate sind unvergleichlich besser wie bei Müller - scher Flüssigkeit allein. Besonders Schridde (10) empfiehlt diese Fixierung. Simons (15) fixiert dafür 5 — 24 Stunden mit einer halt- baren, geruchlosen Chromformolverbindung (Chromoform) in 2,5% Wässer. Lösung. Nach P. Mayer (16a) bietet dieses keine Vorteile. 133. Tellyesniczky (98) empfiehlt, 3%iger Ka- liumbichromatlösung vor Gebrauch 5Proz. Essigsäure zuzusetzen, und 1 — 2 Tage zu fixieren, in reichlichem Wasser auszuwaschen und die Nachbehandlung mit 15% Alkohol zu beginnen (im Dunkeln). Diese einfache Flüssig- keit fixiert Kerne und Protoplasma gleichgut und dringt rasch ein. Der Essigsäurezusatz erfolgt erst unmittelbar vor Gebrauch. 134. Die Bedeutung des Essigsäurezusatzes zum Kaliumbichromat erhellt aus den Untersuchungen von A. Fischer (99); darnach werden durch Kaliumbichromat zahlreiche Eiweißkörper, namentlich aus alkalischer Lösung, nicht gefällt, die alle beim Ansäuern sofort ausfallen. Außer- dem diffundiert Essigsäure sehr rasch. Eine ähnhche Rolle spielt die Essigsäure als Zusatz zu anderen Fixierungsflüssig- keiten. 135. Läßt man langsam fixierende Flüssigkeiten bei höherer Temperatur einwirken, so wird die Fixierungsdauer erhebhch abgekürzt; so kann man z. B. mit Erlickischer Flüssigkeit im Thermostaten bei 40" C, vor Verdunsten ge- schützt, ein Rückenmark des Menschen in 4 — 5 Tagen ge- nügend fixieren. Müllersche Flüssigkeit fixiert in diesen Verhältnissen in 8 — 10 Tagen. Zur Verhütung von Verpil- zung usw. setzt man etwas Thymol zu. Die Objekte werden auf Glaswolle, Filtrierpapier od. dgl. gelegt, damit sie auf allen Seiten von der Fixierungsflüssigkeit umspült werden. Hierauf für gewöhnhch Auswaschen in fheßendem Wasser, bis sie keine Farbe mehr abgeben. (1 — 2 Tage). Dann Alkohol usw. 136. Die in § 128, 130 u. 131 erwähnten Flüssigkeiten eignen sich nicht für das Studium der Kerne, da sie mehr § 137 — 140. Fixation. 35 oder weniger deren Inhalt stark angreifen und zum Teil lösen. Dagegen spielen sie bei der Untersuchung des Nerven- systemes und des Auges eine wichtige Rolle. Ferner werden sie oft zum Härten benützt. Vgl. § 55. 137. Setzt man die Objekte während der Fixierung mit chromhaltigen Flüssigkeiten und bei der Weiterbehandlung im Alkohol der Einwirkung der Lichtstrahlen aus, so bilden sich nach R. Virchow oft sehr störende künstliche Pig- mente, welche unter Umständen mit natürhchen verwechselt werden können. Man stelle die Gläser daher ins Dunkle. Das Licht scheint auch die Löshchkeit der Eiweißfällungen zu beeinflussen. Essigsäure. 138. Essigsäure allein wird zur Fixierung nur sehr selten gebraucht, da sie in dieser Form schlechte Ergebnisse Hefert. Sehr häufig und mit großem Nutzen wird sie da- gegen anderen Fixierungsflüssigkeiten zugesetzt. (Vgl. auch § 134). Als Eisessig bezeichnet man die 100% Essig- säure, während die sog. konzentrierte Essigsäiure 4% Wasser enthält. Verdünnte Essigsäure (z. B. 1%) läßt bei Zusatz zu frischen Präparaten die Kerne infolge der in ihnen entstehenden Niederschläge deutlich hervortreten; das Protoplasma der Zellen wird dabei zum Teil gelöst. ForinoL 139. Das im Handel erhältHche Formol oder For- mal in ist eine 40% Lösung von Formaldehyd in Wasser. Wegen seiner Zersetzlichkeit im Licht bewahrt man es in braunen Flaschen auf. Da das gewöhnliche Formol meist etwas Ameisensäure enthält, wird häufig Verwen- dung des säurefreien Formols von Schering (Berlin) empfohlen. Zur Bindung entstehender Säure gibt Gajal auf den Boden der Formolflasche pulverisierte Kreide. Besser ist vorsichtiges Neutralisieren mit einigen Tropfen einer Lösung von Natriumkarbonat (Soda), s. a. § 558. 140. Zur Fixierung wird 1 Teil des käuflichen For- mols mit 9 Teilen Wasser verdünnt, was einer 4% Formal- dehydlösung oder einer 10% Formollösung entspricht. Man fixiert kleine Objekte 12 — 24 Stunden, größere länger. Nach der Fixierung wird mit Wasser ausgewaschen oder gleich direkt in 96% Alkohol übertragen. ! Fischer (99) sieht eine 25% Formollösung als die rationellste an. Am besten- finde ich die Methode Sjö- 36 Fixation. §141—147. brings (00), der ITeil Formol mit 4 Teilen Wasser verdünnt. Die Objekte werden nach der Fixierung direkt in 96% Alkohol gebracht; bei Untersuchung auf Fett oder Lipoide wegen Gefahr der Lösung natürlich in Wasser. Die Angaben über den Prozentgehalt der zur Fixie- rung benützten Lösung sind in der Literatur häufig un- klar, da sich die Prozentzahl bei den einen Autoren auf den Formaldehyd, bei den anderen auf das Formol beziehen, wobei dann öfters statt Formaldehyd fälschlich Formol angegeben wird. 141. Das Formol ist zurzeit eines der gebräuchUch- sten, bilhgsten Fixierungsmittel. Bei sehr einfacher An- wendungsweise konserviert es Form und Farbe der Prä- parate gut; infolge seines raschen Diffusionsvermögens fixiert es auch bei großen Stücken die Zellstrukturen leid- lich gut. Von besonderem Werte ist seine Eigenschaft, Fette und Lipoide sehr gut zu erhalten. Ferner verleiht es dem Gewebe eine zum Schneiden sehr geeignete Konsi- stenz. Für gewisse feine zytologische Untersuchungen hat es sich dagegen meist nur bei gleichzeitigem Zusatz anderer Fixierer bewährt. 142. Nach Blum beruht die chemische Wirkung des Formols auf einer Methylinierung der Eiweißkörper, mit deren Amidogruppen der Formaldehyd unter Wasserabschei- dung zusammentritt. 143. Hämoglobin kann sich bei der Fixierung in Methä- moglobin, ev. in Hämatin verwandeln, auch in den Kern diffundieren. Die Beurteilung des Pigments wird durch der- artige künsthche Niederschläge erschwert (Weigert 93, Browicz 00). 144. Formahnpräparate können hernach noch mit fast allen anderen Fixierungsflüssigkeiten nachfixiert wer- den (s. auch Hansen 08b); sie lassen sich mit den meisten Methoden färben und können auch mit der Golgischen oder Weigertschen Methode nachbehandelt werden. 145. Formol wird häufig mit anderen Fixierungs- flüssigkeiten kombiniert; der Zusatz erfolgt dabei un- mittelbar vor Gebrauch, da sich die betreffenden Flüssigkeiten nach Vereinigung meist rasch zersetzen. 146. Bei zu langer Fixierungsdauer werden die Präparate manchmal zu hart. Nach Schmidt (10) kann man die Härte durch Einlegen in 1% Silbernitratlösung für 14 Tage oder in 10% Zitronensäure beseitigen. 147. Die bei Formolfixierung manchmal auftreten- den feinen braunen Niederschläge beseitigt man nach §148—150. Fixation. 37 Verocay dadurch, daß man die Präparate auf 10 Minuten in eine Mischung von 1 Teil 1 % wässeriger Kalilauge und 25 Teilen 80% Alkohols bringt; dann 5 Minuten in zweimal gewechseltes Wasser, 5 Minuten in 80% Alkohol, dann aus- waschen in üießendem Wasser. Osmiumtetroxyd. 148. Osmiumtetroxyd (Synonyma: Osmiumsäure, Überosmiumsäure) wurde auf Veranlassung von F. E. Schul - zes von M. Schultze und Rudneff (65) in die Mikro- technik eingeführt. Es ist eine bei Zimmertemperatur sehr flüchtige Substanz, deren Kristalle in zugeschmolzenen Glasröhrchen in den Handel kommen. Zum Gebrauch hält man sie sich in 1% oder 2% Lösung vorrätig. Da Osmiumtetroxyd durch organische Substanz, wie z. B. Staub u. dgl. sehr leicht reduziert wird, so ist die Lösung mit ganz reinem Wasser anzusetzeu und sehr gut zu ver- schließen. P. Mayer empfiehlt, zur Verhinderung der Reduktion zu je 100 ccm Lösung 10 Tropfen einer 5% Sublimatlösung zuzusetzen. Das Licht hat keinen Einfluß darauf. Beim Arbeiten mit Osmiumtetroxyd ist zu beachten, daß seine Dämpfe die Schleimhäute sehr stark reizen. Ein Nachteil ist der hohe Preis (1 g 7 — 12 M.). 149. Osmiumtetroxyd allein wird zur Fixierung gewöhnlich in 1% — 2% wässeriger Lösung angewandt. Es fixiert momentan, dringt aber leider nicht tief in die zu fixierenden Stücke ein, so daß bei größeren bloß die an der Oberfläche des Organs gelegenen Zonen etwa ^/lo mm tief fixiert werden, deshalb fixiere man in gut verschlosse- nem Glase möglichst kleine Stückchen. 0. Schultze (10b) empfiehlt einige 1 — 2 cmm große Stückchen 1 — 2 Tage in 2 — ^3 ccm Flüssigkeit zu fixieren. Nachbehandlung mit allmählich verstärktem Alkohol (im 96% 3 Tage) 'Tgl. auch § 371. Zum Zwecke entsprechender Färbung kann man nach der Alkoholbehandlung noch gründlich v^ässern, vum dann von neuem wieder in steigendem Alkohol zu ent- wässern. Über Bleichung osmierter Präparate siehe § 548. 150. Die Osmiumsäure verändert durch Oxydation die natürlichen Farben bestimmter Gewebe in verschiedenem Grade. So werden z. B. die Kerne schmutzig gelb, Muskeln und elastische Fasern graubraun, Oleinfett, Milchkügelchen, die Marksubstanz der Nebenniere, Nervenmark schwarz; es bilden sich dabei keine Myelintropfen, das Mark wird aber sehr brüchig. Das Protoplasma embryonaler Zellen färbt 38 Fixation. § 151—156. sich intensiver wie das der fertigen. Osmiumsäure allein konserviert die Form der Zelle im ganzen sehr gut, fixiert aber einzelne Zellstrukturen wie z. B. das Chromatin schlecht. Bei zu langer Anwendung tritt Überfixierung ein, die Zellen werden glasig und lassen keine Struktur mehr erkennen. 151. Nervenmark schwärzt sich bei Einwirkung von Osmiumsäure auch an mit Chromsäure, chromsauren Salzen oder Formol fixierten Objekten. Auf vorgefärbte, geeignet fixierte Präparate kann Osmiumsäure ebenfalls angewandt werden. 152. Bei sehr kleinen Objekten wird die Osmiumsäure vorteilhaft auch in Dampf form angewandt (Hansen). Die betreffenden Zellen werden dabei außerordenthch rasch ge- tötet und fixiert, wodurch ihre Form sehr gut erhalten bleibt (z. B. Pseudopodien u. dgl.). Man lasse aber die Dämpfe nicht zu lange einwirken (bei einzelnen Zellen ^2 — 1 Minute, bei mehreren übereinanderliegenden Zellagen 1 — 3 Stunden). Zur Osmium-Räucherung werden einige Tropfen einer Osmiumsäurelösung auf den Boden einer gut verschlossenen Glasdose gegeben und das Objekt derart darüber gebracht, daß es mit der Flüssigkeit selbst nicht in Berührung kommt. Gilson (85) empfiehlt die Räucherung in Dämpfen einer frisch hergestellten Mischung von Osmiumsäure und Essig- säure vorzunehmen. 153. Mit Osmiumsäure fixierte Objekte lassen nach Flemming auch Stückfärbung mit Hämatoxylin oder Alaun- karmin zu, besonders schön werden Präparate von Retina. 154. 0. Schultze färbt mit Erfolg Objekte, die mit l%iger Osmiumsäure und dann mit l%iger Kalium- bichromatlösung mehrere Tage behandelt werden mit Alauncochenille. Die Stücke werden aus dem Kaliumbichro- mat direkt in die Farbe übertragen; besonders gut färben sich die Kerne. 155. Zur Konservierung der Osmiumschwärzung überträgt Heidenhain (07) die Objekte nach sorgfältiger Waschung in destilliertem Wasser in 70% Alkohol, dem etwas Natriumsulfid beigefügt ist. Die Schwärzung wird dadurch intensiver und vollkommen haltbar, während sie gewöhnlich vom Kanadabalsam allmählich stark angegriffen wird. 156. Osmiumsäure allein ist nach A. Fischer (99) ein sehr schwaches und unvollständiges Fällungsmittel für Eiweiß- körper. Bei alkahscher Reaktion erzeugt sie keine Eiweiß- niederschläge. Bei geringem Ansäuern mit Essigsäure fallen die genannten Stoffe sofort in wasserunlöslicher Form aus. Bei den essigsäurehaltigen Osmiumsäuregemischen werden die zu fixierenden Elemente durch die rascher diffundierende Essigsäure angesäuert, bevor die Wirkung der Osmium- säure zur Geltung kommt. § 157—162. Fixation. 39 167. Außerordentlich wertvoll sind verschiedene Os- miumsäuregemische derselben, von denen die Chrom- Osmium-Essigsäure (Flemmingsche Flüssigkeit) bereits in § 125 angeführt wurde. 158. Hermannsche 3Iischung. Ebenfalls mit aus- gezeichnetem Erfolg wendet man Platinchlorid-Osmium- säure-Eisessig an (1% wässerige Platinchloridlösung 15ccm; 2% Osmiumsäure 4ccm; Eisessig 1 ccm). Be- handlung wie mit Flemmingscher Flüssigkeit (Her- mann 93). 159. Nach Flemming quellen die chromatischen Sub- stanzen in Hermannscher Flüssigkeit etwas, wodurch z. B. die frühen Verdoppelungsstadien der Chromosomen an den mit ihr fixierten Objekten nicht zu sehen sind. 160. Nach der Hermannschen wie Flemmingschen Lösung und ähnlichen Osmiumgemischen kann man die Ob- jekte auf 12 — 24 Stunden in rohen Holzessig legen. Dann wäscht man kurz aus und behandelt mit Alkohol. Es tritt hierbei eine eigentümliche Färbung des Objektes ein, die eine nachträgliche Färbung oft entbehrlich macht (Hermann 93). Phosphorwolframsäure. 161. Rawitz (08) fixiert in Phosphorwolframsäure, welche »eines der mächtigsten Fällungsmittel der Eiweiß- stoffe« ist. Zusammensetzung: Phosphorwolframsäure in Lösung (Kahlbaum) 40 ccm; Alkohol 95% 50 ccm; Eisessig 10 ccm. Letzterer wird erst vor Gebrauch zu- gesetzt. Nach 24 Stunden direkt in 70% Alkohol usw. Die Alkohole sollen oft gewechselt werden und bis zu 48 Stunden einwirken. Pikrinsäure. 162. Pikrinsäure wird allein oder in Gemischen viel- fach zum Fixieren verwandt. Für gewöhnlich benützt man sie als kaltgesättigte wässe- rige Lösung (in 100 ccm H2O löst sich bei IS"' etwas über 1 g). (Zusatz von 3 — 5 ccm Eisessig empfehlenswert.) Man fixiert, je nach Größe des Objektes, 1 — 24 Stunden, unter Umstän- den auch mehrere Tage (vgl. § 852). Auch Pikrinsäure-Eis- essig (100:5) fixiert gut. Nach der Fixierung dürfen die Prä- parate nicht in Wasser ausgewaschen werden, sondern müssen gleich in 70% Alkohol gebracht werden, der öfter gewechselt wird. Ein völliges Herauswaschen der Pikrinsäure ist lang- wierig und unnötig. Falls Stückfärbung erwünscht ist, be- nütze man alkoholische Hämatoxylin- oder Karminlösungen. 40 Fixation. § 163—166. Mit basischen Anilinfarben gibt Pikrinsäure Niederschläge, mit sauren nicht. 163. Sehr gute Resultate gibt die von B6uin an- gegebene Mischung (15 ccm gesättigte, wässerige Pikrin- säurelösung, 5 ccm Formol und 1 ccm Eisessig). Die Lö- sung dringt rasch ein und fixiert besonders Mitosen sehr gut. Fixierungsdauer bei kleinen Stücken (5 cmm) 1 bis 2 Stunden, bei größeren entsprechend länger. Hierauf sogleich in 70 — 80%igen öfters gewechselten Alkohol. 164. Die Pikrinschwefelsäure von Kleinenberg wird folgendermaßen hergestellt: Man setzt zu 100 ccm einer ge- sättigten, wässerigen Pikrinsäurelösung 1 ccm konzentrierte Schwefelsäure, wobei sich ein reichlicher Niederschlag bildet. Nach 24 Stunden wird abfiltriert und das Filtrat mit dem zweifachen Volumen Wasser verdünnt. Man fixiert kleine, möglichst nicht über ^ cm dicke Stücke ca. 3 — 6 Stunden. Die Flüssigkeit dringt rasch ein. Auswaschen in 70% Alkohol. Für Organe mit reichlichem Bindegewebe ist die Flüssigkeit unbrauchbar, da die Schwefelsäure dasselbe stark quellen läßt. In kalkhaltigen Objekten entsteht leicht ein kaum ent- fernbarer Gipsniederschlag. 165. Den letzteren Übelstand vermeidet die Pikrin- Salpeterisäure von P. Mayer. Man setzt zu 100 ccm gesättigter wässeriger Pikrinsäure 2 ccm offizineller Salpetersäure, fil- triert nach einiger Zeit von dem allmählich entstehenden Niederschlag ab. Das Filtrat ist ohne weitere Verdünnung zum Gebrauch fertig. Anwendung wie bei § 164. Beide Flüssigkeiten fixieren besonders Mitosen gut, und dringen auch durch Ghitinhüllen u. dgl. gut durch, sind aber in den meisten Fällen zweckmäßiger durch die Bouinsche Flüssig- keit zu ersetzen. 166. Pikrinsublimat. (Rabl 94.) 100 ccm gesättigte wässerige Pikrinsäurelösung, 100 ccm gesättigte wässerige Subhmatlösung, 200 ccm Aqu. dest. ; Fixierung 12 Stunden; dann ein paar Stunden in Wasser (besser zu vermeiden, Romeis), dann in Alkohol von anfangs schwacher, jedoch rasch ansteigender Konzentration, so daß das Präparat schon nach etwa 24 Stunden in starkem 80 — 90% Alkohol hegt. Jodtinkturzusatz zum absoluten Alkohol. Von Rabl für Keimscheiben und namentlich ältere Embryonen empfohlen. Schaffer (96) empfiehlt diese Lösung unverdünnt (also Pikrin-Subhmatlösung aa) für Gewebe und Organe. Fixie- rung 12 — 48 Stunden. Dann direkt in 70% — 80% Alkohol, dem man Jodtinktur und Lithiumkarbonat zur Entfernung des Sublimats und der Pikrinsäure zusetzt. Von den vom Rath (95) angegebenen Flüssigkeiten seien folgende drei erwähnt: § 167—173. Fixation. 41 167. Die Plkrinosmium-Essigsäure. Zu 1000 ccm kalt- gesättigter wässeriger Pikrinsäurelösung werden 1 g Osmium- säure und nach einigen Stunden 4 ccm Eisessig hinzugefügt. Fixierung je nach der Größe des Objektes % — 1 oder 24 bis 48 Stunden, dann direkt in 75% igen Alkohol. (Ein anderes Rezept lautet: 200 ccm Pikrinsäurelösung, 12 ccm einer 12% igen Osmiumsäure und 2 ccm Eisessig.) Lange färben. Die Kerne und das Protoplasma werden gleichgut fixiert. 168. Die Pikrinosmium - Platinchlorid - Essigsäure. Zu 200 ccm wässeriger konzentrierter Pikrinsäure gieße man 25 ccm einer 2% igen wässerigen Osmiumsäure, ferner lg Platinchlorid in 10 ccm Wasser gelöst und schließHch 2 ccm Eisessig zu (starke Lösung). Will man eine schwache Lösung, so nehme man nur 12 ccm einer 2% igen Osmiumsäure an Stelle von 25 ccm. Einwirkung, je nach Größe des Objektes %Stunde bis tagelang, im letzteren Falle muß die Flüssigkeit gewechselt werden. Übertragen in 75, dann in 95*^oigen und absoluten Alkohol nach eventueller 12 — 24 stündiger Behandlung mit unreinem Holzessig. In Safranin und dann Hämatoxylin lange färben, auch ungefärbt untersuchen. 169. Pikrin- Sublimat- Osmiumsäure. Man gebe zu 100 ccm wässeriger Pikrinsäure 100 ccm Sublimatlösung und dann 20 ccm 27oger Osmiumsäure. (Man kann auch noch 2 ccm Eisessig hinzufügen.) Nachbehandlung mit rohem Holzessig oder Tannin, Entfernung von Subhmatniederschlägen mit Jodalkohol. Lange färben. Platinchlorid. 170. Platinchlorid wurde von Rabl (85) in einer Lösung 1 : 300 zur Fixierung chromatischer wie achromati- scher Figuren empfohlen. 171. Besser ist die Platinchlorid- Sublimatiuischung (Rabl 94). 1% wässerige Platinchloridlösung 10,0; ge- sättigte wässerige Sublimatlösung 10,0; Aqu. dest. 20,0. Anwendung wie bei Pikrinsublimat s. § 166. Große Quan- titäten Fixierungsflüssigkeit! Geeignet besonders für Em- bryonen. 172. Platinchlorid-Chromsäure (Merckels Gemisch) be- steht aus Platinchlorid 1 g, Chromsäure 1 g und 800 ccm Wasser. Fixierungsdauer mehrere Tage. Auswaschen in 50 — 70% Alkohol. Über Platinchlorid-Osmium-Essigsäure (Hermanns Gemisch) siehe §158. Sublimat. 173. Sublimat [Hydrargyrum bichloratum, Queck- silberchlorid, in dieser Gebrauchsart eingeführt von Lang 42 Fixation. § 174—176. (78)] löst sich in Wasser bei Zimmertemperatur ungefähr im Verhältnis von 1:16, in absolutem Alkohol 1:3, Äther 1:4. Lösungen in destilliertem Wasser sind nach P. Mayer unbegrenzt haltbar. Von anderen Autoren wird zu diesem Zweck Koch- salzzusatz empfohlen. Zum Fixieren benützt man gewöhn- lich eine gesättigte wässerige Lösung. Man löst dazu etwa 75 g Sublimat unter Erwärmen in 1000 ccm Wasser und läßt nach Filtrieren erkalten. Gewöhnlich bilden sich dabei am Boden noch einige weiße Kristallnadeln. Fixierungs- dauer je nach Größe % — ^^ Stunden, bei ganz kleinen Objekten genügen wenige Minuten. Man gehe für gewöhn- lich nicht über 0,4 mm Seite. Sodann Übertragen in 70% Alkohol usw. Auswaschen in Wasser ist unzweckmäßig. 174. Da die zur Fixierung verwandte Sublimat- lösung für eine bestimmte Temperatur gesättigt ist, so bilden sich namentlich bei Temperaturschwankungen in den zu fixierenden Stücken leicht kristallinische und amor- phe Sublimatniederschläge, die später in den Schnitten schwarz erscheinen und sehr störend werden können. Auch alle anderen sublimathaltigen Fixierungsgemische können die Entstehung derartiger Niederschläge veranlassen, die schon vielfach zu Mißverständnissen geführt haben und daher genau zu studieren sind. 175. Zur Entfernung der Sublimatniederschläge setzt man nach P. Mayer. (87) am besten nach der Fixierung zum 70 und 80% Alkohol einige Tropfen Jodtinktur (Her- stellung: 10 g Jod auf 100 ccm 96% Alkohol) oder alkoho- lisches Jodjodkali (2:3: 100ccm90%igen Alk.), bis er kognak- braune Farbe hat. Dies wird solange wiederholt, bis die gelbe Farbe des Alkohols nicht mehr schwindet. Der bei Gebrauch von Jodtinktur manchmal entstehende rote Niederschlag löst sich in Jodkalium, s. a. P. Mayer (19a). Die Entfernung der Sublimatniederschläge kann auch erst auf den Schnittpräparaten erfolgen, doch rät Spul er (09), sie bereits nach der Fixierung am Stück vorzunehmen. 176. Entjodung. Da Jod für die meisten Färbungen, insbesondere für Anilinfarben, sehr schädlich ist, so muß auch dieses wieder vöUig entfernt werden. Heidenhain (08 a) empfiehlt, die Schnitte dazu einige Minuten in einer 0,25% Natriumthiosulfatlösung zu bleichen, die man sich durch Verdünnen aus einer 2,5% Stammlösung her- stellt. Spul er (10) nimmt auch die Entjodung schon am Stück vor. § 177—184. Fixation, 43 177. Bei Fixierung mit sublimathaltigen Flüssigkeiten hat man metallene Instrumente zu vermeiden. Man ver- wende daher Hornlöffel, Glasnadeln und Holzstäbchen. 178. Sublimat allein verursacht leicht Protoplasma- schrumpfungen; die Kerne soll es ohne Zusatz jedoch nach Ansicht mancher Autoren besser fixieren als in Verbindung mit anderen Stoffen. Es läßt die meisten Färbungen zu. Neben den Schnittfärbungen gelingen besonders auch die Stückfärbungen mit Karmin (vgl. auch § 337 f.). 179. Sublimat- Kochsalzlösung wird statt mit destil- liertem Wasser mit 0,5 oder 0,75% Kochsalzlösung ange- setzt. Anwendung wie bei § 173. 180. »In der mit Sublimat gesättigten Rohrzuckerlösung haben wir eine für Warmblüter isotonische Fixierungs- flüssigkeit gefunden, in der das Volumen der Organe so gut wie unverändert bleibt.« (Stoeltzner). 181. Nach Heidenhain (17) treten die bei Verwen- dung von gesättigter Sublimat- oder Sublimatkochsalz- lösung häufig zu beobachtenden Schrumpfungen nicht auf, wenn man die Lösungen zur Hälfte mit Wasser ver- dünnt. Sehr vorteilhaft ist es, besonders bei bindegewebe- reichen Organen, der verdünnten Sublimatlösung 20% Formalin zuzusetzen: Sublimat-Formol (also Sublimat 4,5; Kochsalz 0,5; Wasser 80,0; FormaUn 20,0). Fixierungsdauer 2 — 24 Stun- den, dann reiner 70% Alkohol usw. 182. Sublimatalkohol (Apathy): 3 — 4g Sublimat; 0,5 g Kochsalz, 100 com 50% Alkohol. Fixierungsdauer 12 — 24 Stunden, dann wie § 181. Schaudinn verdünnt 2 Teile konzentrierte wässerige Sublimatlösung mit 1 Teil absolutem Alkohol und fixiert warm (60 — 70^). 183. Sublimat-Eisessig (Lang), eine gegenwärtig besonders auch für Kern- und Protoplasmastudien viel gebrauchte Flüssigkeit, welche für embryonales Gewebe und für wenig Bindegewebe enthaltende Organe Vorzüg- liches leistet. Zu einer gesättigten wässerigen Sublimat- lösung fügt man 5 — 10% Eisessig. Fixierungsdauer % bis 6 Stunden. Übertragen in 70% Alkohol usw. Bei größeren Stücken wird Nachfixierung mit reiner Sublimatlösung angeraten. 184. Zenkersche Flüssigkeit. Zenker (94) fügt zu 100 ccm Müllerscher Flüssigkeit 5 g Sublimat und dazu vor Gebrauch! 5 ccm Eisessig. (Also: 2,5 g Kahumbichro- mat; lg Natrium sulfuric; 5g SubHmat; 100 ccm H2O und 5 ccm Eisessig.) Hierin werden die Stücke je nach 44 Fixation. § 185—189. ihrer Größe 1 — 24 Stunden fixiert ; sodann wird mit fließen- dem Wasser ebensolange ausgewaschen und allmählich in starken Alkohol überführt (Jodzusatz!). 185. Helly setzt zur Zenkerschen Stammlösung statt Eisessig 5 ccm Formol zu. (Unmittelbar vor Gebrauch!) Man soll die Flüssigkeit nach Möglichkeit nicht länger als 6 Stunden einwirken lassen (ev. im Thermo- staten fixieren). Größere Stücke fixiert man noch ca. 24 Stunden in der Flüssigkeit ohne Formolzusatz nach. Sodann sorgfältiges Auswaschen mit Wasser usw. wie bei § 184. Sowohl die Zenkersche wie die Hellysche Fi- xierungsflüssigkeit dringt sehr leicht in die Gewebe ein und fixiert Kern- und Protoplasmastrukturen sehr gut, ohne hiebei das Färbungsvermögen zu beeinträchtigen. (Siehe auch Mercier (94) und Spuler (10).) Für sehr wasserhaltige Gewebe ist sie weniger geeignet. 186. Maximow (09) setzt zu 100 ccm der Zenker- schen Stammlösung 10 ccm Formol. Fixierungsdauer 1 — 6 Stunden. In vielen Fällen empfiehlt es sich nach Maximow, zu der genannten Zenker-Foi'moUösung noch 10 ccm einer 2% Osmiumsäurelösung zuzufügen. Die Fixierungsdauer kann dann auf 24 Stunden und mehr verlängert werden. Die Schnitte färben sich gut. Das Fett wird osmiert. Nach Fixierung in beiden Fällen gründliches Auswaschen (24 Stunden). 187. Das Gilsonsche Gemisch besteht aus Sublimat 20 g; 60% Alkohol 100,0; Wasser 880,0; Salpetersäure (80%; spez. Gew. 1,456) 15,0; Eisessig 4 ccm. Fixierungsdauer je nach Größe 14 Stunde bis 6 Stunden; sodann direkt in 70% Alkohol. Das Gemisch dringt sehr rasch ein und fixiert gut. 188. Petrunkewitsch empfiehlt: Wasser 300,0; absol. Alk. 200,0; Eisessig 90,0; Salpetersäure 10,0; SubUmat bis zur Sättigung. Anwendung wie bei §187 Gilson. Salpetersäure. 189. Eine 2 — 3% Salpetersäure (Acid. nitric. puriss. mit 70% Säuregehalt und 1,40 spez. Gewicht) fixiert, auf kleine Stücke angewandt, gut, namentlich Kernstruk- turen. Fixierungsdauer: 1 — 6 Stunden (nicht länger, da sonst Mazeration eintritt). Nach der Fixierung übertrage man direkt in 70% Alkohol, nach 24 Stunden in 80% usw.; 5% und stärkere Lösungen verursachen, besonders an der § 190—195. Fixation. 45 Oberfläche des Stückes, Schrumpfungen; Chromatin er- scheint vakuohsiert (Tellyesniczky). 190. Die Per^nyische (82) Flüssigkeit hat folgende Zu- sammensetzung: Salpetersäure von 10% 40,0: absol. Alk. 30,0; ^% wässerige Chromsäure 30,0; sie fixiert kleine Ob- jekte in wenigen Stunden. Auswaschen in 70% Spiritus. (Das Protoplasma wird gut erhalten, ebenso die Chromatin- fäden; das Achromatin löst sich auf.) Nach P. Mayer wenig empfehlenswert. Über die Gemische von Gilson s. §187, Petrunkewitsch s. §188, Pikrinsalpetersäure §165. Trichloressigsäure. 191. Trichloressigsäure (Holmgren, Heidenhain 05 b) fixiert gut in 5 — 10% Konzentration und in kurzer Zeit, da sie rasch eindringt (1 — 24 Stunden). Nach der Fi- xierung behandle man die Stücke direkt mit 96% oder ab- solutem Alkohol, den man oft wechsle. Man vermeide Wasser, da in diesem das Bindegewebe stark quillt. Trichloressig- säure und ihre Mischungen wirken gleichzeitig auch ent- kalkend. 192. Heidenhain (08b) empfiehlt unter der Be- zeichnung »Subtrie« ein Gemisch von konzentrierter Sub- limatlösung 100 ccm, Trichloressigsäure 2 g, Eis- essig 1 ccm. Man fixiert eiuie bis mehrere Stunden und überträgt dann sofort in 90% Alkohol, der einige Male ge- wechselt werden muß. 193. Neuerdings modifizierte Heidenhain (16) die Flüssigkeit (Susa) wie folgt: Sublimat 4,5; Kochsalz 0,5; Wasser 80,0; Tri- chloressigsäure 2,0; Eisessig 4,0; Formalin 20,0. Nach der Fixierung wird in 90% Alkohol übertragen usw. 194. Romeis (18) fixiert in einer Mischung von "gesättigter wässeriger Sublimatlösung 25 ccm; 5% Tri- chloressigsäure 20 ccm; Formalin 5 ccm. Kleine Stücke werden nach 1 — 2 Stunden, größere nach 3 — 24 Stunden in 80 — 90% Alkohol übertragen, der mehrmals gewechselt wird. 195. Friedenthal und Po 11 nehmen konzentrierte Uranylacetatlösung, 50% Trichloressigsäure und de- stilhertes Wasser zu gleichen Teilen. Nach der Fixierung wird im Gegensatz zu obigen Gemischen mit Wasser ausge- waschen und dann mit Alkoholen von steigender Konzentration nachbehandelt. 46- Durchtränkung und Einbettung. § 196—198. Fixierung durch Trocknen in der Kälte. 196. Alt mann (94) empfiehlt kleine Organstückchen bei einer Temperatur von etwa — 25*^0 im Vakuum über Schwefel- säure vollständig zu trocknen und anschließend im Vakuum gleich mit Paraffin zu durchtränken. Nach A. bleibt dabei neben ausgezeichneter Erhaltung der Struktur auch die Reaktionsfähigkeit der Gewebe in ihrem natürhchen Zustand erhalten. Das Schwierigste ist dabei, während des mehrere Tage dauernden Trockenprozesses ein Ansteigen der Tem- peratur auf — 15® zu verhüten, da sonst Schrumpfungen ein- treten. 5. Kapitel. Durchtränkung und Einbettung. 197. Fixierte Objekte besitzen nicht immer die zum Schneiden nötige Beschaffenheit; so sind manche so weich, daß sie dem schneidenden Messer nicht genügend Wider- stand bieten, andere enthalten große Hohlräume und wür- den beim Schneiden auf das stärkste deformiert, wieder andere sind zu klein und zu zai^t, als daß man sie überhaupt mit den Fingern anfassen könnte usw. All diesen Übel- ständen kann man dadurch abhelfen, daß man das Ob- jekt mit einem Medium durchtränkt, das nachher zu einer festen, gut schneidbaren Masse erstarrt. Dann schneidet sich das Ganze wie die Einbettungsmasse allein, vorausgesetzt, daß da^ Objekt nicht härter als letztere ist. Je nach der Art der zur Durchtränkung benützten Substanz werden dabei verschiedene Wege eingeschlagen. Die gebräuchlichsten Einbettungsmedien sind zur Zeit Paraffin und Gelloidin. Außerdem kommt haupt- sächlich noch Gelatine in Betracht. 198. Anwendung der einzelnen Medien. Für die Mehrzahl der bei histologischer und embryologischer Untersuchung verfolgten Zwecke ist Paraffin [zuerst Klebs (69)] das geeignetste Einbettungsmittel. Es ist unentbehrlich, wenn es sich darum handelt, sehr dünne Schnitte (1 — 5 /j) zu machen. Serien lassen sich rascher und leichter von Paraffinmaterial wie von Gelloidinmaterial anfertigen. Ein weiterer Vorzug ist, daß die Einbettung in Paraffin rascher und einfacher vor sich geht und die in Paraffin eingebetteten Objekte beliebig lange aufgehoben werden können, ohne daß eine Änderung zu befürchten wäre. Das Durchtränken mit Celloidin ist dagegen besonders bei großen Stücken (2 cm Seite und darüber) von Vorteil ; §199. Durchtränkung und Einbettung. 47 ferner bei Geweben, die durch die bei Paraffineinbettung nicht vermeidbare Erhitzung leicht zu hart werden, wie z. B. Haut, entkalkter Knochen, dicke Schichten glatter Muskulatur u. a. Für gewöhnlich sind auch die Schrump- fungserscheinungen bei Anwendung der Celloidineinbettung geringer. Von Nachteil ist, daß der Einbettungsprozeß längere Zeit beansprucht, daß sich die Gelloidinblöcke nur angefeuchtet und in der Regel nicht so dünn wie Paraffin- präparate schneiden lassen. Ferner ist das Aufkleben der Präparate auf den Objektträger etwas umständlicher. Sehr empfehlenswert ist eine Vereinigung beider Metho- den, die Celloidinparaffinmethode, bei der die zuerst mit Celloidin durchtränkten Präparate nachträglich noch in Paraffin eingebettet werden. Über die Gelatineeinbettung, welche hauptsächlich nur füi' spezielle Fälle in Betracht kommt, siehe § 239. 199. Verhalten verschiedener Zwischenflüssigkeiten zu Cel- loidin, Paraffin, Alkohol und Wasser. Name Celloidin Paraffin abs. Alkohol Wasser Aceton Äther Alkohol (absol.) . . . . Anilinöl Benzin Benzol Benzylalkohol Bergamottöl Chloroform Methylbenzoat (Ersatz f. Nelkenöl) Nelkenöl Origanumöl Paraffinöl Petroläther Schwefelkohlenstoff . . Terpineol Terpentinöl Toluol Xylol Zedernholzöl + + + etwas i. d. Wärme 4- + + + + + 90% Alk. '+ + 907oAlk. 80% Alk. + 907oAlk. 907o Alk. 90% Alk. + + 907oAlk. + + 95% Alk. 12:1 + -f- = mischbar: — = nicht mischbar. (Es wurde dabei nur die für die Praxis in Betracht kommende Mischbarkei t berücksichtigt.) 4S A. Paraffineinbettung. § 200—206. A. Paraffineinbettung. a) Durchtränken mit dem Intermedium. 200. Die wichtigste Vorbedingung ist, daß die Ob- jekte völlig Wasser- und alkoholfrei sind. Dem Einbettungs- prozeß hat infolgedessen die Entfernung des Wassers wie des Alkohols aus dem fixierten Präparat vorauszugehen. Zunächst erfolgt das erstere, und zwar dadurch, daß man die Präparate aus dem mehr oder weniger wasserhaltigen Alkohol in absoluten Alkohol überträgt, durch den sie allmählich entwässert werden. Da er dabei Wasser aufnimmt, muß er, um den gewünschten Zweck zu erreichen, ein- bis zweimal erneuert werden. Die Dauer des Aufenthaltes richtet sich nach der Größe und Beschaffenheit des Prä- parates. Vgl. auch § 224. 201. Besonders Apathy (12) hat neuerdings wieder in einer für die Einbettung und Schneidetechnik sehr wertvollen Arbeit die Notwendigkeit der Entfernung von Wasser und Alkohol betont. »...Ein tadelloses Einbetten in Paraffin läßt sich nur erzielen, wenn das Objekt vollkommen wasser- frei ist und auch vom Alkohol keine Spur enthält. Das Schrumpfen und Hartwerden, die schlechte Schneidbarkeit des Objektes in Paraffin kommt meist daher, daß es noch Wasser oder Alkohol, oft beides enthält.« 202. Entwässern des Alkohols. Läßt man 96% Alkohol mit reichlichem gebrannten Kalk (GaO) etwa 2 Tage stehen und filtriert ab, so erhält man einen mehr als 99,9% igen Alkohol, der nur minimale Spuren CaO (etwa 0,001%) ent- hält. Durch DestiUieren statt Filtrieren lassen sich auch diese entfernen. In gleicher Weise kann man auch den käuflichen absoluten Alkohol, der meist noch 1 % Wasser enthält, vöUig entwässern. 203. Auch mit Calcium läßt sich der Alkohol völlig ent- wässern (L. W. Winkler 05). 204. Eine weitere Methode ist die Entwässerung mit chemisch reinem pulverisiertem Kupfersulfat, das bei 200^ G geröstet wurde. Man schüttelt den Alkohol damit und läßt absetzen. Das Kupfersulfat färbt sich durch Auf- nahme der vorhandenen Wasserspuren allmählich blau. Zur Bindung etwa auftretender freier Säurespuren setzt man etwas geschabte Kreide zu. 205. Absoluten Alkohol prüft man auf Wasserfreiheit durch Zusatz von einem Korn Galcium-Carbid ; bei Wasser- gehalt Trübung und Gasblasen. 206. Die nicht minder wichtige Entfernung des Al- kohols erfolgt durch Übertragen des entwässerten Ob- jektes in eine Zwischenflüssigkeit, welche sich einerseits § 207—211. A. Paraffineinbettung'. 49 mit Alkohol, andrerseits mit Paraffin mischt. Von den zahl- reichen dazu empfohlenen Flüssigkeiten seien hier nur Benzol, Toluol, Xylol, Petroläther (Ligroin), Schwefel- kohlenstoff, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, dann ver- schiedene Öle wie Terpentinöl, Bergamottöl, Zedernholzöl genannt vgl. auch § 199. 207. Für gewöhnliche Zwecke sowie für den Anfänger empfiehlt sich am meisten der Gebrauch von chemisch reinem wasser- und alkoholfreiem Benzol oder Toluol. 208. Benzol (Siedepunkt 80^0 hat vor Toluol (Siedepunkt 111^) noch den Vorzug, daß es flüchtiger ist und doch ziemlich viel Paraffin löst. Die in Benzol oder Toluol gebrachten Objekte werden nach einiger Zeit durch- scheinend; tritt beim Übertragen der Präparate in Benzol eine Trübung auf oder bleiben in ihrem Innern milchige Stellen bestehen, so ist das ein Zeichen für ungenügende Entwässerung. Man bringe die Objekte in diesem Falle wieder in Alkohol zurück. Die Zeitdauer der Durchtränkung mit Benzol richtet sich nach der Größe des Objektes und schwankt zwischen einer halben und mehreren Stunden. Vgl. auch § 224. 209. Beim Übertragen des Objektes aus dem Alkohol in eines der Intermedien entstehen Diffusionsströme, die namentlich in zarten Objekten starke Schrumpfungen und Zerreißungen veranlassen können. Deshalb kann man bei dieser Prozedur gar nicht vorsichtig genug sein. Bei feineren Untersuchungen bringt man daher die Präparate nicht direkt aus absolutem Alkohol in Benzol, sondern setzt dasselbe nur allmählich dem Alkohol zu und geht erst dann zum reinen Benzol über. Oder man verwendet der Reihe nach Mischungen von absolutem Alkohol und Benzol wie 2:1; dann 1:1; 1:2, und schheßlich reines Benzol. 210. Xylol ist wegen des höheren Siedepunktes (140*') ^. weniger zu empfehlen. Schwefelkohlenstoff (besonders von Heidenhain und von Frederici [08] empfohlen) ist sehr gut, gegen allgemeine Verwendung spricht aber seine außer- ordentliche Feuergefährlichkeit (Entzündung schon bei löO**) und sein Geruch. 211. Das beste und schonendste Intermedium ist Chloroform, das für feine Arbeiten dem Benzol vorzuziehen ist. Nachteilig ist neben dem Kostenpunkt der Umstand, daß das im Handel erhältliche Chloroform häufig wasser- und alkoholhaltig ist. Aber auch ganz reines Chloroform zersetzt sich leicht und wird dadurch wasserhaltig. Aus Romeis, Taschenb. d. mikrosk. Technik. 8. Aufl. 4 50 A. Paraffineinbettung. 1 212^215. diesen Gründen ist für Anfänger und Kurszwecke das Ar- beiten mit Benzol oder Toluol vorzuziehen. 212. Das hohe spezifische Gewicht des Chloroforms be- ^ nützt man zweckmäßig zur allmählichen Durchtränkung des Präparates in der Weise, daß man in einem Glastubus eine Chloroformsäule mit absolutem Alkohol überschichtet und das anfangs an der Grenzfläche beider Flüssigkeiten schwimmende Präparat sich langsam im Chloroform zu Boden senken läßt. (Senkverfahren.) Hierauf überträgt man es noch 1 — 2 mal in reines Chloroform. Oft kommt es vor, daß die Objekte im reinen Chloroform nicht zu Boden sinken. Man kann das dann durch Zusatz von etwas wasserfreiem Äther (ca. 1 ccm auf 100 Chloroform) oder Paraffin erreichen. 213. Um Chloroform alkohol- und wasserfrei zu machen, empfiehlt Kempf (10) es längere Zeit über Calciumchlorid stehen zu lassen, das entwässernd wirkt und zugleich den Al- kohol bindet. Wegen seiner Zersetzlichkeit hebt man derartig gereinigtes Chloroform nach Filtrieren lichtgeschützt in klei- nen, bis an den Hals ^gefüllten, braunen Glasflaschen auf. 214. Von den Ölen wird als Intermedium meistens Zedernholzöl oder Terpentinöl gebraucht; im Gegensatze zu den oben genannten Flüssigkeiten ist hier bei der Ein- bettung in Paraffin ihre völlige Entfernung nicht not- wendig, da sie mit reinem Paraffin nach P. Po so (10) und Apathy (12) sogar ein gut schneidbares Gemisch bilden. Man überträgt von Zedernholzöl direkt in geschmol- zenes heißes Paraffin. Wenn die Objekte im Öl schwimmen, bedeckt man sie, um einem Vertrocknen der Oberfläche vorzubeugen mit etwas ölgetränkter Watte. 215. Um beim Durchtränken und Einbetten Schrump- fungen möglichst zu vermeiden, unterschichtet O. Schnitze (07) den absoluten Alkohol, in dem die einzubettenden Stücke liegen, mit Zedernholzöl. Sind dieselben dann nach einigen Stunden untergesunken, dann wird der darüber befindhche Alkohol abgesogen und das Zedernholzöl durch ganz reines ersetzt. Aus diesem kommen die Stücke direkt in Paraffin vom Schmelzpunkt 36*' (von Grübler) und schließlich mög- lichst kurz (je nach der Größe; Retina z. B. nur für eine Mi- nute) in Paraffin von 45 — 48^, in das eingebettet wird. Ge- schnitten muß bei ca. 10 — 12^C werden, unter Abkühlung der Blöcke z. B. mit Eissalzmischung o. a. § 225. Pranther überträgt aus absolutem Alkohol für 24 Stun- den in Zedernholzöl, dann 12 Stunden in Ligroin, ebenso- lange in Ligroin -Paraffin, dann nach 14 stündigem Aufent- halt im Thermostat für 3 — 6 Stunden in reines Paraffin. Große Stücke muskulöser Organe (z. B. Uterus, Herz) bringt man durch abs. Alkohol und Zedernholzöl in 2— 3 mal gewechseltes reines Zedernholzöl (6 — 10 Tage bei 37®) und von § 216—219. A. Paraffineinbettung. 51 hier in mehrmals erneuertes reines Paraffin (Schmelzp. 56"; 2 — 8 Tage je nach Größe). Das Öl kann man mit Chlorcal- zium wieder entspriten. b) Übertragen des Objektes in das Paraffin. 216. Ist das Objekt von dem Intermedium (Benzol, To- luol, Chloroform od. dgl.) völlig durchtränkt, so fügt man die- sem im Überschuß Paraffinstückchen zu und stellt die Misch- ung in einer flachen Schale in den auf der Oberfläche des Wärmeofens gewöhnlich angebrachten Vorwärmer, der etwa 37 — 40^ zeigt. Hier verdunstet ein Teil des Intermediums, während das Paraffin in das Präparat eindringt. Nach einigen Stunden (über die Zeitdauer vgl. § 224) bringt man das Objekt mit einem angewärmten Spatel in das heiße Paraffin, das in flachen Schalen im eigentlichen Wärmeofen steht. Um das vorhergehende Intermedium möglichst zu verdrängen, überträgt man das Objekt hier noch 1 oder 2 mal in frisches Paraffin. 217. Von manchen Autoren wird empfohlen, die Ob- jekte aus einer kaltgesättigten Lösung von Paraffin und In- termedium zunächst in weiches Paraffin vom Schmelzpunkt SS** und nach einigen Stunden erst in Paraffin von hohetn Schmelzpunkt zu bringen. V. Apathy (12) dagegen hält das Durchtränken mit einer Mischung von Intermedium und Paraffin oder mit Paraffin von niedrigem Schmelzpunkt für zwecklos und überträgt aus dem Intermedium gleich in das Paraffin, in dem einge- bettet werden soll. 218. Paraffinsorten. Je nach der Temperatur, bei welcher man schneiden muß, und je nach der gewünschten Schnittdicke ist man gezwungen, Paraffin von verschie- denen Schmelzpunkten zu benützen, bei niederer Tem- peratur von 50^ G, bei höherer zu 58^60^ C. Für gewöhn- lich ist ein Paraffin von 55—56^ C zu empfehlen. 219. Durch entsprechendes Mischen von weichem ( Schmelz- punkt 45— 54°) und hartem (Schmelzpunkt 58 — 60*^) Paraffin kann man den Härtegrad beliebig einstellen. Nach v. Apa- thy ist das gewöhnUche Paraffin des Handels für exaktes Arbeiten meist unbrauchbar, da es häufig noch gasförmige Bestandteile enthält, wodurch der Block beim Einbetten blasig, bröckehg und schlecht schneidbar wird. Man halte es sich da- her im Vorrat und lasse es für längere Zeit in flachen Schalen bei 70'' G stehen. Öfteres Filtrieren und Erkaltenlassen bessert seine Beschaffenheit. Am besten ist oft gebrauchtes Paraffin (Abfall und Überreste von alten Blöcken), das man vor Wieder- verwendung im Wärmeofen filtriert. Van Walsem und 52 A. Paraffineinbettiing. §220—223. Kabsch (12) setzen dem Paraffin (Seh. 56«) 5% gelbes Bienen- wachs zu, wodurch sich die Schneidbarkeit bessern soll. Altmann mischt 425 g Paraffin (Schm. 60^) mit 50 g Stearin und 25 g Wachs. Das Gemisch ist besonders für dickere Schnitte (10 — 25 u) gut, da die Schnitte sehr ge- schmeidig sind und die Masse nicht splittert. Für Schnitte unter lO^a ziehe ich gutes, reines Paraffin ohne Beimischung vor. 220. Graf Spee (85) empfiehlt namentlich für Bänder- schneiden überhitztes Paraffin. Darstellung: Paraffin von Schmelzpunkt 50<^ G wird in geschmolzenem Zustand längere Zeit erhitzt, bis es unter Entwicklung weißhcher unangenehm riechender Dämpfe eine braungelbe Farbe angenommen hat. (Auch von Grübler beziehbar.) 221. Als Wärmeofen oder Thermostat dient ein doppel- wandiger mit einer Tür versehener Kasten, der durch Gas oder Elektrizität geheizt wird. Der Raum zwischen den dop- pelten Wänden wird mit Wasser oder Glyzerin gefüllt. Zur Konstanterhaltung der Temperatur dient ein entsprechender Thermoregulator. 222. Der Thermoregulator besteht in einfachster Form aus 2 Glasröhren, welche ineinandergeschoben sind, ohne sich zu berühren. Durch die innere, engere Röhre strömt Gas in die weitere, umfassende. Letztere ist oben und unten geschlossen; durch eine seitliche Öffnung strömt das Gas wieder aus zum Brenner. Die engere Röhre reicht nicht ganz bis zum Boden der weiteren Röhre. Ein Teil der weiteren Röhre ist mit einer Flüssigkeit, z. B. Quecksilber, gefüllt. In dieses taucht man, wenn die gewünschte Temperatur des Ofens erreicht ist, die Spitze der engeren Röhre, welche schief abgeschnitten ist, ein. Steigt die Temperatur, so wird auch die Quecksilbersäule steigen und das Loch allmähhch verschließen, so daß weniger Gas durchströmt. Um bei raschem Steigen und vollständigem Verschluß der Röhre ein Erlöschen der Flamme zu verhüten, befindet sich oben in der engen Röhre eine kleine Öffnung, welche stets ein sehr geringes Ausströmen des Gases gestattet. Moderne Regulatoren sind zwar nach diesem Prinzip, aber abweichend in der Ausführung gebaut. 223. Bei Gasheizung setzen sich auf dem Quecksilber des Thermoregulators mit der Zeit Verunreinigungen ab, wo- durch die Genauigkeit der Temperaturregulierung beeinträch- tigt wird. Quecksilber und Röhren müssen dann gereinigt werden. — Über die Mündung des Gasbrenners lege man ein Käppchen aus feinem Drahtnetz, wodurch das Zurück- schlagen und Rußen der Flamme verhindert wird. — Am rein- lichsten und konstantesten arbeiten elektrisch geheizte Ther- mostaten. § 224—226. A. Paraffineinbettung. 53 224. Die Zeitdauer, welche das zu durchtränkende Stück in den einzelnen Medien zu bleiben hat, richtet sich nach der Größe des Stückes. Am längsten muß es in absolutem Alkohol bleiben, um das Stück wasserfrei zu machen, und in der Benzol-Paraffinmischung, um ein möglichst vollständiges Verdunsten des Intermediums und so ein allmähliches Überführen in reines Paraffin herbeizuführen. Die Zeit variiert je nach Größe und Dichtigkeit des Objektes. Ungefähre Zeitmaße (in Stunden) gebe folgende Tabelle: Kleine Objekte unter 1 mm Seite MittlereObjekte bis ft mm Seite Große Objekte über 6 mm Seite Absol. Alkohol . . . Benzol 2—4 6—12 2—4 24 3—6 Von jetzt ab weiter im Thermostat: Benzol-Paraffin bei 40» C Paraffin bei 58-60° C 1 V2 4—6 1—2 6—12 3—4 . 225. Größere Objekte müssen entsprechend länger durchtränkt werden. Nach Apathy (12) lasse man die Objekte lieber länger als zu kurz im geschmolzenen Paraffin. Wenn das Objekt gut entwässert und vor allem auch der Alkohol vollkommen entfernt ist, dann schaden auch Tage und Wochen nichts. Ist das nicht der Fall, dann allerdings wird das Resultat um so schlechter, je länger das Verweilen in reinem geschmolzenen Paraffin dauert. c) Das Einbetten. 226. Erst wenn das Präparat völlig mit Paraffin durch- tränkt ist, wird es durch Erstarrenlassen desselben ein- gebettet. Als Form benützt man für mittlere Objekte zweck- mäßig zwei Doppelwinkel aus glattem Metall ( -i r )j welche auf eine glattpoherte Metallplatte (am besten Messing oder Kupfer) aufgesetzt werden. Durch gegenseitiges Verschieben der Winkel läßt sich die Größe der Form variieren. Benützt man als Unterlage eine Glasplatte, so muß man diese mit etwas Glyzerin einreiben, damit sich der Paraffinblock leicht ablöst. 54 A. Paraffineinbettung. §227 — 229. 227. Vielfach verwendet man auch Papier- oder Stanniol- kästchen. Für sehr kleine Objekte bedient man sich mit Vorteil eines Uhrschälchens als Form. [Siehe auch § 231.] 228. Beim Einbetten verfährt man folgendermaßen: Nachdem man die Einbettungsrähmchen auf der sauber geputzten Grundplatte hergerichtet hat, erwärmt man das Einbettungsparaffin auf etwa 70^ G und gießt davon sorgfältig, ohne Luftblasen mitzureißen, in die Form. Dann überträgt man mit einem über der Flamme erwärmten Metallspatel das einzubettende Präparat. Hierauf wird das Objekt orientiert, d. h. mit einer erwäi'mten Zupf- nadel in die Lage gebracht, in der es hernach geschnitten werden soll. Die Orientierung ist für manche Objekte sehr notwendig, da später, wenn das Paraffin erstarrt und undurchsichtig ist, eine solche beim Einspannen in das Mikrotom (s. auch § 251) erschwert, ja bisweilen un- möglich ist. Ist das Objekt orientiert, so wartet man, bis die Oberfläche des Paraffins zu einem Häutchen erstarrt, was man durch Anblasen desselben befördern kann. Dann wird das ganze horizontal in kaltes Wasser gebracht und untergetaucht. Dabei muß das Wasser gleich von allen Seiten her rasch über die Blockoberfläche laufen. Tritt das Wasser nämlich nur von einer Ecke her langsam auf das flüssige Paraffin, so drückt es sich hier infolge seines höheren spezifischen Gewichtes in die weiche Oberfläche ein, und bohrt sich tiefe wassergefüllte Gänge meist bis in unmittelbare Nähe des Objektes. Nach etwa 15 Min. ist der Block erstarrt und mit Leichtigkeit aus der Form zu nehmen. 229. Die Temperatur des Wassers beträgt am besten 120— 150 C, jjei kälterem Wasser bekommt der Block leicht Sprünge und starke Einziehungen. Das Erstarren unter W^asser ist nach Carazzi notwendig, da das langsam an der Luft erstarrende Paraffin nicht so homogen wird, und sich nicht so gut schneidet. Andere Autoren empfehlen die Form nur bis an den oberen Rand der Einbettungsrähmchen ins Wasser zu tauchen und die Oberfläche des Paraffins mit einem warmen Spatel so lange flüssig zu halten, bis es von unten her erstarrt ist. Nur auf diese Weise werden nach V.' Apathy die letzten Spuren des vorausgegangenen Inter- mediums verdrängt. Ich persönlich ziehe im allgemeinen das Erstarrenlassen unter Wasser vor. Es lassen sich aber mit beiden Methoden gute Resultate erreichen. Das wichtigste ist, daß das Objekt von reinem Paraffin völlig durchdrungen ist und daß das Einbettungsparaffin gut und rein §230—232. B. Celloidineinbettung. 55 ist. Besonders bei der letztgenannten Methode ist ferner notwendig, daß sich über dem Objekt noch eine mindestens 0,5 cm breite Paraffinschicht befindet. Unbedingt schädüch für die Schnittfähigkeit ist langsames Erstarrenlassen an der Luft ohne Abkühlung von unten her. 230. Zur Erleichterung der Orientierung- kann man auf den Boden der Form kleine, paraffindurchtränkte, dünne Papierstückchen (Zigarettenpapier), auf denen ein gerader Tuschestrich angebracht ist, legen und mit einbetten. Man orientiert dann die Objekte derart, daß die spätere Schnitt- ebene parallel dem Tuschestrich zu liegen kommt. P. Mayer verwendet kleine Gelatineplättchen, auf die die Objekte vor der Paraffindurchtränkung mit einer Lösung von Celloidin in Methylbenzoat festgeklebt werden (16 b). 231. Kleine Objekte, die nicht orientiert werden brauchen, überträgt man nach P. Mayer aus dem absoluten Alkohol in kleine überall erhälthche Gelatinekapseln, welche man in ausgestanzte Korkstücke steckt, und behandelt die Objekte weiter, wie wenn sie in Glastuben wären. Schheßhch ersetzt man nach völhger Durchtränkung das Paraffin mit Hilfe einer angewärmten Pipette durch reines Einbettungsparaffin und bringt die Kapsel in kaltes Wasser, in dem das Paraffin er- starrt und die Gelatine sich leicht ablöst (16a). Über die Weiterbehandlung des Paraffinmaterials s. §242. B. Celloidineinbettung. 232. Herstellung der Celloidin lösiing (nach Apathy 12). Das in Tafeln käufliche Celloidin (von Schering) muß zuerst zu kleinen Würfelchen (3 — 5 cmm) zerschnitten werden, die, auf einer Lage Filtrierpapier ausgebreitet, staubfrei bei Zimmertemperatur getrocknet werden. Die gelblichen, kornartigen Würfelchen können dann in einer gut verschlossenen Flasche vorrätig aufbewahrt werden. Zur Einbettung bedarf man einer 2%-, 4%- und 8% -Lösung, die man sich in Kappenflaschen mit gut ein- 'geschliffenem Glasstöpsel herstellt. Man füllt in diese soviel wasserfreien Äther-Alkohol (siehe unten), daß nur noch Raum für die zur gewünschten Konzentration nötige Menge getrockneter Gelloidinstückchen bleibt, die man ein- zeln in die Lösung hineinfallen läßt. Nach etwa 12 Stunden kehrt man die Flasche um und stellt sie auf die Kappe, wobei das am Boden bereits gequollene Celloidin langsam unter Lösung gegen den Flaschenhals sinkt; nach weiteren 12 Stunden dreht man die Flasche wieder um und hat nun, also nach 24 Stunden, eine 2% -Lösung. Für eine 4%- 56 B. Celloidineinbettung. § 233—235. Lösung braucht man nach der gleichen Methode 2 Tage, für eine 8%- 3 Tage, während welcher Zeit man immer nach 12 Stunden die Flasche wieder umkehrt. Der Kappen- schliff der Glasflaschen muß durch Vaseline abgedichtet werden. 233. Äther entwässert man am besten mit metalli- schem Natrium, das man in Form von Drahtspiralen auf den Boden der Flasche gibt. Die mit diesem Äther und mit absolutem Alkohol (gleiche Volumteile) hergestellte Mi- schung bewahrt man in gut eingeschliffenen, \'aselinegedich- teten Kappenflaschen auf. Wasserhaltiger Äther gibt mit der gleichen Menge Schwefelkohlenstoff geschüttelt eine Trü- bung. Alkoholfreier Äther muß bei Zusatz von etwas Anilin- violett in Substanz farblos bleiben. 234. Torbereituiig der Objekte. Die durch abso- luten Alkohol auf das sorgfältigste entwässerten Objekte kommen zunächst in wasserfreien Äther-Alkohol, der nach einigen Stunden rasch abgegossen und durch eine 2%- Celloidinlösung ersetzt wird. Nach 24 Stunden kommen sie in die 4%- und nach weiteren 24 Stunden in die 8%-Cello- idinlösung. Schwer durchdringbare Objekte müssen in der 2% — 4% -Lösung mehrere Tage bis Wochen verbleiben. 235. Einbettung der Objekte. Man benützt dazu Glasdosen mit flachem Boden oder Glasringe mit einge- schliffener Boden- und Deckelscheibe. Zur Einbettung wird der Ring mit etwas Gummisyrup in der Ringfurche der Bodenscheibe festgeklebt. Dann gießt man in den Ring eine 8%-Celloidinlösung und überträgt und orientiert die Präparate. Sind dabei Luftblasen entstanden, so legt man für einige Stunden den Deckel auf die Schale. Das nun folgende Eindicken der Lösung darf nicht an der Luft erfolgen, sondern muß in einem Exsikkator vor sich gehen, in dem eine Schale mit konzentrierter Schwefelsäure aufgestellt ist. Als Exsikkator kann man z. B. auch eine auf eine Glasplatte aufgeschliffene Glasglocke benützen. Damit die Celloidinlösung gleichmäßig eindickt, ist es empfeh- lenswert, zeitweise auf den Einbettungsring die Deckel- scheibe aufzusetzen. Ist die Celloidinlösung auf die Hälfte eingedickt, so stellt man das Einbettungsgefäß in eine gut verschheßbare Schale, die etwas 70% - Alkohol enthält und härtet auf diese Weise etwa 24 Stunden mit Alkohol- dämpfen an (ev. mehrmals Deckel auflegen). Endlich kommt der erstarrte Celloidinblock in den 70% - Alkohol selbst. Bei richtiger Einbettung muß sich der alkohol- §236—237. B. Gelloidineinbettung. 57 gehärtete Celloidinblock auf 5 fx schneiden lassen. Nimmt man die Entwässerung weniger genau, so gehngen meist nur 15 jA dicke Schnitte. Die Celloidinstücke werden dann in Ziegelform zu- geschnitten und in 70% - Alkohol aufgehoben ( Alkohol- celloidin). Über das Aufblocken und Schneiden siehe §244. 236. Ölcelloidininethode. Die in Alkohol-Celloidin eingebetteten Objekte müssen feucht geschnitten werden, was verschiedene Nachteile mit sich bringt. Um dies zu vermeiden, hat man verschiedentlich versucht, den Cello- idinblock statt mit Alkohol mit nicht trocknenden Ölen zu durchtränken. Die beste Methode ist die von Apathy (12): Die Einbettung geht zunächst wie beim Alkohol-Celloidin vor sich (§ 234ff). Dann wird der in 70% -Alkohol (nicht Chloroform) gehärtete Block in 90%- Alkohol gelegt. Nach 24 Stunden wird der Block in fol- gendem unbegrenzt haltbaren Ölgemisch (braune Flasche!) entwässert: 4 Gewichtsteile Chloroform, 2 Gewicht st eile Origanumöl, 4 Gewichtsteile Zedernholzöl, 1 Gewichtsteil absoluter Alkohol , 1 Gewichtsteil Karbolkristalle. Alle Bestandteile müssen wasserfrei sein. Ist der Block voll- kommen durchsichtig (ohne Trübung) geworden, dann wird das Ölgemisch nach je 24 Stunden noch zweimal gewechselt. Wasserhaltig gewordenes Ölgemisch kann man durch Zu- setzen von Natriumsulfat wieder entwässern. Hierauf kommen die Blöcke in wasserfreies Terpineol (von Schimmel & Co.), das zur Entfernung des Ölgemisches 1 — 2 mal gewechselt wird. Die damit durchtränkten Blöcke werden in Terpineol oder trocken in Glastuben ver- schlossen aufbewahrt. Da das Celloidin durch das Öl ganz aufgehellt wird, ist es oft gut, es etwas anzufärben. Zu dem Zweck setzt man dem 70%- oder 90% -Alkohol etwas -alkoholische Safraninlösung zu. (Über das Aufkleben und Schneiden der Blöcke siehe § 245, 253, 289 und 293.) 237. Eine weitere Ölcelloidinmethode ist von Lee und von Wolfrum angegeben worden. Man bettet zunächst am besten wie in § 235 geschildert in Celloidin ein, setzt aber die eingedickte Masse nicht Alkohol-, sondern Chloroform- dämpfen aus. Dazu bringt man das Einbettungsgefäß in eine zweite, gut abschließbare Schale mit Chloroform am Boden. Die Dämpfe härten das Celloidin ohne Schrumpfung in etwa 12 Stunden. Die aus der gehärteten Masse ausge- schnittenen Blöcke kommen in ein Gemisch aus Chloroform 58 B. Ceiloidineinbettung. § 238 und Zedernholzöl zu gleichen Teilen; man bedecke das Ge- fäß mit Papier und stelle es in einen Wärmeofen bei 30 — 40'' C. Nach 1 — 2 Tagen ist das Chloroform fast ganz verdunstet. Die Blöcke kommen noch auf 12 Stunden in reines Zedern- holzöl. Vor dem Aufkleben läßt man den Block einige Stun- den an der Luft liegen. Aufblocken nach § 245. Man schneidet trocken bei senkrechter oder leicht schräger Messerstellung, sammelt die Schnitte in 85%-Alkohol, welcher einige Male zur Entfernung des Öles gewechselt wird usw. Die durch- sichtigen Blöcke werden in einer verschlossenen Schale mit etwas Zedernholzöl am Boden aufbewahrt. Die Methode läßt sich auch für makroskopische oder Lupendemonstrationen in Zedernöl verwenden. Arbeitet man bei Einbettung und Durchtränkung mit wasserfreien Reagenzien, so tritt an der Luft keine Schrumpfung der Blöcke ein; wasserhaltige Blöcke bröckeln oder schieben sich dagegen beim Schneiden und sind wenig brauchbar. (Über das Aufkleben der Schnitte siehe § 289.) 238. Celloidinparai't'in. Von großem Werte ist die Celloidin-Paraffinmethode, mit deren Hilfe die Gewinnung 1 f.1 dicker, nicht deformierter Schnitte ohne besondere Schwierigkeit gelingt. Sie vereinigt Vorteile der Paraffin- einbettung mit solchen des Celloidinverfahrens. Für zarte, bei Paraffineinbettung leicht schrumpfende Objekte ist sie ganz besonders zu empfehlen. Am besten verfährt man dabei nach den Angaben von Apathy (12): Zunächst kommen die in absolutem Alkohol völlig entwässerten Objekte wie in §234f. durch Alkohol-Äther in 2%-, 4%- und 8%-Celloidin. Dieses kann man noch weiter auf 16% ein- dicken, oder aber man stellt das Einbettungsgefäß schon mit der 8% -Lösung in eine gut verschlossene Schale, auf deren Boden etwas Chloroform ausgegossen ist. (Keine Alkoholhärtung!) Benutzt man einen Einbettungsring, so wird er bei der Par. -Cell. -Einbettung nicht mit Gummi- sirup, sondern mit Paraffin aufgeklebt. Durch die Chloro- formdämpfe wird das Celloidin in wenigen Stunden so gehärtet, daß man es in einzelne Blöcke zurechtschneiden kann, welche dann noch auf 24 Stunden in Chloroform ge- bracht werden. Von hier kommen sie auf 24 Stunden zur Entfernung jeglicher Wasserspur in das in § 236 an- gegebene Ölgemisch, w^orauf wiederum dieses und der noch enthaltene Alkohol durch mehrfach gewechseltes Benzol entfernt ward. Sodann legt man den Block auf min- destens 24 Stunden in das heiße Paraffin. Zur Einbettung nimmt man den Block aus dem Paraffin, legt ihn zwischen zwei Objektträger und taucht ihn in kaltes Wasser. §239—240. C. Gelatineeinbettung. 59 Ölcelloidinblöcke (nach Apathy) können leicht in Pa- raffincelloidinblöcke umgewandelt werden, indem man vor der Paraffineinbettung durch Benzol das Terpineol entfernt. Die Blöcke müssen vorher aber mit dem Ölgemisch ent- wässert worden sein. C. Gelatineeinbettung. 339. Hier sind hauptsächlich die Methoden von Apa- thy und von Gaskell anzuführen. Die letztere vermeidet jeglichen Alkohol, ferner Benzol u. dgl. sowie Erwärmung über 38^, gibt aber weniger sichere Resultate als die Apathy sehe Methode, bei der jedoch die Objekte bis zu 96% Alkohol kommen und auf 45 — 60^ erwärmt werden müssen. Nach Apathy ist es allein nach diesem Einbet- tungsverfahren möglich, die strukturlose, interstitielle Grundgallerte vollkommen ungeschrumpft zu erhalten. Es eignet sich aber nur für kleine, höchstens 6 mm dicke Stückchen. A. empfiehlt es besonders auch für Rekon- struktionen. Man arbeitet dabei am besten mit Stück- färbung. 240. Methode von Apathy: a) Herstellung der Ein- bettungsmasse: 50 g Gelatine von der feinsten käufhchen Sorte in trockenen Blättern werden in 175 g destillierten Wassers und 25 g Glyzerin warm gelöst, im Thermostaten filtriert und eben dort über Chlorcalcium bis zum vollkomme- nen Verdunsten des Wassers eingedickt. Nach Erkalten der Masse, die warm eben noch in Faden zu ziehen ist, wird sie in kleine Würfelchen zerschnitten, die in diesem Zustand in gut verschlossener Flasche unbegrenzt aufbewahrt werden können. b) Durchtränkung und Einbettung des Objek- tes: Die zuerst bis zum 96%-Alkohol durchgeführten Objekte müssen zunächst vom Alkohol befreit und allmählich in Gly- zerinwasser (4 Volumteile Glyzerin, 5 Volumteile Wasser) übergeführt werden. Um Schrumpfungen zu vermeiden, .- kann man das Glyzerinwasser mit destilHertem Wasser, 35%-, 70%- und 90%-Alkohol überschichten und das Objekt sich allmählich herabsenken lassen. { Kann einige Tage dauern. ) Schließlich wird das Glyzerinwasser zur Entfernung jeglicher Alkoholspur mehrmals gewechselt; dann setzt man zu ihm das gleiche Volumen einer Gelatinelösung, die durch Lösen von 3 Teilen der oben beschriebenen Gelatinemasse in 7 Teilen warmen Wassers hergestellt wird. Darin bleibt das Objekt im zugekorkten Tubus mindestens 24 Stunden bei 40° C. Hierauf gießt man sie in das Einbettungsgefäß, stellt es in eine große, gut verschließbare Glasschale, auf deren Boden Chlorcalcium liegt und bringt das ganze wieder in den Thermo- 60 G. Gelatineeinbettung. §241. staten bei 45 — 60". Nun wird so lange eingedickt, bis die ur- sprüngliche Lösung auf die Hälfte konzentriert ist. Dann nimmt man das Gefäß aus dem Wärmeschrank und läßt die Lösung erstarren. Man bekommt so eine Masse, welche etwa 1 Teil Gelatine, 3 Teile Glyzerin und 1 Teil Wasser enthält. Für die Schnittfähigkeit ist dieses Verhältnis am günstigsten. Ist zuviel Wasser in der Masse, dann kommt es später im Al- kohol zu Schrumpfungen, ist zu wenig darin, dann wird die Substanz zu hart. Die erstarrten Blöcke schneidet man auf einer mit Paraffin, liquid, bestrichenen Glasplatte zurecht, indem man das mit Öl oder Paraffin. Hq. benetzte Messer hindurchdrückt, nicht zieht. Block zweckmäßig nicht dicker als 5 — 6 mm. Der- selbe wird dann mit einer Stecknadel auf der Unterseite eines Korkes befestigt und dieser auf einen etwa 50 ccm ab- soluten Alkohol enthaltenden Tubus gesetzt, so daß das Gly- zerin und Wasser allmählich durch Alkohol entfernt wird. Nach 24 Stunden wird das Präparat in gleicher Weise in neuen, wasserfreien absoluten Alkohol gebracht. So wird es mehrere Tage gehärtet (für jeden Milhmeter 1 Tag). Dann wird der Kork mit Block und Nadel auf einen mit Terpineol gefüllten Tubus gesetzt. Der Alkohol ist in ebensoyielen Tagen durch das Öl ersetzt und der Block schnittfähig. (Über das Schneiden siehe §246 und 261.) Bei derartig eingebettetem Material läßt sich beim Schnei- den auch bei ganz geringer Schnittdicke jeghche Deformation vermeiden, weshalb diese Methode besonders für Rekonstruk- tionen ausgezeichnet ist. 241. Methode von Gaskell. Feinste Gelatine wird in kleinen Stückchen kurze Zeit (ca. 3 — 4 Minuten bei 19" C) in destilliertem Wasser gequollen, mit der Hand ausgedrückt und in einem mit Deckel versehenen Becherglas auf dem Wasserbad verflüssigt. In diese dicke, bei 37° C zähflüssige Masse wird das einzubettende Objekt für 2 — 5 Stunden bei 37" C eingelegt. Sodann gießt man sie in ein geeignetes Pa- pierkästchen und läßt bei Zimmertemperatur erstarren. Hierauf härtet man mindestens 3 Tage in Formoldämpfen, indem man die Kästchen in eine gut verschließbare Glas- dose auf Holzwolle od. dgl. stellt und auf den Boden etwas Formol gießt. (Die Kästchen können hier ohne Schaden längere Zeit bleiben, für längeres Aufheben empfiehlt sich 5%-Formol). Das einzubettende, vorher fixierte Objekt muß formahnfrei gewesen sein, da sonst keine gute Durchtränkung erfolgt. Der gehärtete Block wird zurechtgeschnitten, auf 1 — 2 Stun- den in Wasser gelegt und sogleich auf das Gefriermikrotom gebracht, wo er sich leicht in 10 ^, ja sogar 5 ^ dicke Schnitte ' zerlegen läßt. Die Schnitte werden in kaltem Wasser auf- gefangen. Fäi'bung mit Hämalaun von P. Mayer, wobei § 242—245. D. Aufblocken des Objektes. CA sich die Gelatine nur schwach mitfärbt. Bei Färbung mit Sudan III oder Scharlach R bleibt sie farblos; ebenso wird sie nach Nilblausulfat A wieder farblos, wenn man mit 1%- Essigsäure differenziert. Eindecken mit Glyzeringelatine. Der Wert dieser Methode beruht darin, daß jegUche Al- koholeinwirkung vermieden wird und die Fettsubstanzen ausgezeichnet erhalten bleiben. Ferner Gräff 16. Zum Auffangen der gefrorenen Schnitte verwende ich statt Wasser eine 5%ige Formollösung. D. Aufblocken des Objektes. 242. Das in Paraffin eingebettete Objekt wird mit einem Messer zu einem Würfel zugeschnitten, wobei man von 5 Seiten des rechteckigen Stückes möglichst viel überflüssiges Paraffin wegschneidet. Mit der 6. Seite wird das Stück auf ein in die Klammer des Objekthalters passendes Holz- oder Stabilitblöckchen aufgeschmolzen. (Apathy empfiehlt dazu 2 — 3 cm lange Zylinderstücke aus weißem Lindenholz, die man sich aus einem Stab von 1^4 CJ^ Durchmesser herstellt.) Das Aufblocken geschieht in der Weise, daß man mit einem heißen Metallspatel etw^as heißes Paraffin auf das Holzblöckchen auftropft, und so- dann den Paraffinblock, dessen Unterfläche mit dem heißen Spatel bestrichen wurde, rasch aufdrückt. Hierauf werden die Seitenwände mit dem heißen Spatel noch etwas ange- schmolzen und das ganze in kaltes Wasser getaucht. 243. Ähnlich werden Paraffincelloidinblöcke aufge- blockt. 244. Alkoholcelloidinblöcke werden mit einer dicken Celloidinlösung aufgeklebt. Man legt dazu den Holzklotz auf kurze Zeit in Alkohol-Äther, tropft dann etw^as dick- flüssige Celloidinlösung auf und drückt den Celloidinblock, dessen Unterfläche kurz in Äther getaucht worden war, ,iest auf. Das seitlich vorquellende Celloidin kratze man ab, da reines Celloidin nach Apathy nur dann ein sicheres Aufkleben zuläßt, w^enn es in äußerst dünner Schicht sofort trocknen kann. Sodann härten für einige Stunden in 70% Alkohol. 245. Viel besser ist das Verfahren von Apathy, der sowohl Alkohol — wie Ölcelloidin mit Nelkenölcelloidin aufklebt (hergestellt aus 3 Teilen einer 16% -Celloidin- lösung in Äther-Alkohol und 1 Teil Nelkenöl; statt des letzteren nehme ich, um den Geruch zu vermeiden, das von P. Mayer vorgeschlagene Metylbenzoat). »Der Block 62 Das Mikrotom. § 246—249. wird etwas abgetrocknet, die Aufklebefläche mit Filtrier- papier etwas abgerieben, Block und Holzblock werden mit etwas Nelkenölcelloidin bestrichen, aneinandergedrückt und etwas aneinander gerieben, um die Klebemasse gleich- mäßig auszubreiten.« Nach einigen Minuten kommen Al- koholcelloidinblöcke auf 1 — 2 Stunden in 70% Alkohol. Ölcelloidin bleibt etwa % Stunde an der Luft stehen und kommt dann auf einige Stunden in Terpineol. 246. Gelatineblöcke werden mit Gelatine, ölgelatine- blöcke mit Nelkenölcelloidin aufgeklebt. 6. Kapitel. Das Mikrolom. 247. Da das Schneiden mit dem Rasiermesser be- trächtliche manuelle Geschicklichkeit erfordert und auch dann noch keine exakte Vorherbestimmung der Schnitt- dicke zuläßt, suchte man diesen Mängeln durch Konstruktion von Schneidemaschinen, den sog. 3Iikrotomen, zu begeg- nen, welche die ziemlich mühelose Herstellung aufeinander- folgender Schnitte von genau bestimmbarer Dicke gestatten. Dieses Ziel wird bei den einzelnen Konstruktionen auf ver- schiedenem Wege erreicht, und zwar lassen sich haupt- sächlich drei Konstruktionsprinzipien unterscheiden. Bei dem einen wird das Objekt durch Vorschieben auf einer ansteigenden Schlittenbahn gehoben und durch ein auf einer horizontalen Bahn laufendes Messer abgeschnitten; bei der zweiten Konstruktionsart erfolgt die Hebung des Objektes gleich direkt in vertikaler Richtung durch eine Mikrometerschraube; beim dritten Typus wird das Ob- jekt an der feststehenden Messerschneide vorbeigezogen und bei jedem Schnitt um einen bestimmten Betrag vor- geschoben. Am gebräuchlichsten sind die nach den beiden erstgenannten Prinzipien gebauten Schlittenmikrotome, während das nach dem dritten Typ konstruierte Minot- mikrotom hauptsächlich nur für Paraffinserien in Be- tracht kommt. 248. Zur Einführung für den Anfänger seien kurz die Bestandteile eines relativ einfach gebauten und doch vorzügHch arbeitenden Schlittenmikrotomes (nach Thoma von Jung in Heidelberg gebaut) beschrieben, zumal auch die meisten anderen Mikrotome in ähnlicher Weise kon- struiert sind. 249. Bei einem Jungschen Schlittenmikrotom trägt eine senkrecht stehende Metallplatte, welche auf einer hori- § 250—253. Das Mikrotom. 63 zontalen Fußplatte aufgeschraubt ist, zwei Schlittenbahnen, eine untere, langsam ansteigende, und eine obere, horizontal verlaufende. Auf der oberen sitzt der das Messer tragende Messerschlitten auf der unteren der das Objekt haltende Objektschlitten, der durch die Mikro- meterschraube des Mikrometerschraubenschlitten ver- schoben werden kann. Messer- und Objektschlitten laufen, um die Reibung zu vermindern, mit Metall- oder Elfen- beinplättchen auf drei plangeschliffenen Schienen. 350. Auf dem Messerschlitten wird durch eine Flügel- schraube ein Messerhalter befestigt, der das horizontal liegende Mikrotommesser trägt. Durch diese Vorrichtung kann die Messerschneide quer oder schräg zum Objekt eingestellt werden (vgl. § 254). Um auch ein Verstellen der Schneidefacetten des Messers zu gestatten (vgl. § 253), was für feinere Arbeiten häufig nötig wird, ist die Benützung eines sog. »verstellbai^en« Messerhalters zu empfehlen. 251. Der Objektschlitten trägt den Objekthalter, im einfachsten Falle eine höher oder tiefer stellbai^e Klam- mer, in die das Objekt durch eine Schraube »eingespannt« wird. Statt der einfachen Klammer werden auch Vorrich- tungen konstruiert, welche ein Verstellen und Neigen des Objektes nach allen Seiten ermöglichen. Für feinere, speziell embryologische Untersuchungen, bei welchen das Objekt genau in eine bestimmte Schnittebene eingestellt werden muß, ist ein derartiger Orientierungsapparat un- entbehrlich. 252. Die Bewegung des Objektschlittens erfolgt durch eine Mikrometerschraube, welche an einem eigenen Schlitten, dem Mikrometerschraubenschlitten, eingelassen ist. Der- selbe kann durch eine seitliche Klemmschraube an der -Schlittenbahn fixiert werden. Die Achse der Mikrometer- schraube trägt eine mit Gradeinteilung versehene Trommel, durch die der Betrag einer Umdrehung bestimmt werden kann. Beim Jungschen Schlittenmikrotom ist die Trom- mel in 15 Intervalle eingeteilt; jedes Intervall entspricht der Schnittdicke von 1/1000 mm = 1/^; eine volle Um- drehung der Schraube ist demnach = 15 //. Die Umdre- hungsbestimmung wird an komplizierteren Modellen durch mechanische Einschnappvorrichtungen vereinfacht. 253. Die Mikrotommesser sind in der Regel plan- konkav, die plane Seite wird dem Präparat zugekehrt. 64 Das Mikrotom. § 254—257. Die Schneide der Mikrotommesser trägt zur Erleichterung des späteren Schleifens einen Facettenschliff. Die Neigung der unteren Facettenfläche zur Oberfläche des zu schneidenden Präparates ist für die Erzielung eines schönen, nichtdeformierten Schnittes von großer Wichtigkeit. Sie ändert sich, je nachdem man Paraffin, Celloidin oder Ge- latine schneidet. Für gewöhnhch muß die untere (dem Ob- jekt zugekehrte) Facette des Messers der Objektfläche min- destens parallel sein, wenn sie beim Schneiden keinen Druck ausüben soll. Eine geringe Neigung des Messers, so daß zwischen der unteren Facette und der Schnittfläche ein klei- ner Winkel (nicht über 16"!) entsteht, ist häufig von Vorteil. Benützt man einen verstehbaren Messerhalter, so ist die beste Neigung des Messers durch Probieren leicht zu ermitteln. 254. Die Messerschneide wird entweder quer oder schräg zum Objekt eingestellt. Für gewöhnlich schneidet man mit schräg gestelltem Messer; notwendig ist dies bei Celloidin, weichem Paraffin u. dgl. Je schiefer die Messerstellung, desto weniger Widerstand bietet das Messer, weil der in Betracht kommende Facettenwinkel nicht in ganzer Größe zur Wirkung kommt. Die Form der Schnitte ändert sich in weichem Paraffin am meisten, weniger in hartem Paraffin oder Celloidin. 255. Mit quergestelltem Messer (Quermesser) arbeitet man besonders beim sog. Bänderschneiden. Hier- bei wird der Schnitt nicht vom Messer weggenommen, er bleibt vielmehr mit seinem hinteren Rande an der Messerschneide kleben und verbindet sich dann beim näch- sten Schnitt mit dem vorderen Rande des folgenden Schnittes. So kann man eine ganze Reihe von Schnitten zu einem Band aneinanderkleben lassen. Notwendig ist es dabei, dem Paraffinblock eine rechteckige Form zu geben (die Schmalseiten parallel der Messerschneide). Bänderschnei- den ist nur möglich bei nicht zu dicken Schnitten, sorgfäl- tigem Einbetten in gutes Paraffin, bei geeigneter Tempera- tur (z. B. 19— 20« C bei Paraffin von Seh. p. 58« und einer Schnittdicke von 7 /.i) und mit gut geschliffenem Messer. 256. Genaueres über die Winkel der Facetten, Neigungs- grad des Messers, Schleifen und Abziehen desselben usw. bei Apathy 97 u. 12. 257. Um das Rosten der vor Berührung mit Säuren sorgfältig zu schützenden Messer zu verhüten, halte man sie in Etuis und reibe ihre Flächen bei längerem Nichtgebrauch mit Vaseline oder Terpineol ein. Bei dem sehr empfehlenswerten neueren Modell H von Jung und dem Reichertschen Schlittenmikro- §258. Das Mikrotom. 65 tom wird der Objekthalter direkt senkrecht gehoben, was gegenüber der Verschiebung auf der schiefen Ebene Vorteile bietet. Für große, exakte Schnitte kommt beson- ders das ausgezeichnete Tetrandermikrotom von P. Mayer (10) in Betracht. Zur Herstellung großer Gehirn- schnitte werden eigene Mikrotome konstruiert. 258. Allgemeine Vorschriften zum Gehrauch des Mikrotoms. Vor dem Gebrauche müssen die Schlittenbah- nen des Mikrotoms gesäubert und mittels eines Pinsels mit Mineralöl (oder statt dessen mit einem Gemisch von 4 Teilen säurefreien Knochenöles und 1 Teil Petroleum) eingeölt werden. Der Schlitten muß leicht und gleich- mäßig laufen. Die Ölschicht dai^f aber auch nicht zu dick sein, da sonst die Schnittdicke leicht unregelmäßig wird. Von Zeit zu Zeit putzt man die alte, mit Staub ver- unreinigte Ölschicht von den Schienen mit etwas Toluol od. dgl. sorgfältig weg und ölt frisch ein. Laufen die Schlitten auf Glasschienen, so wird nicht geölt. Sodann wird der nach § 242 auf einem Holzklötzchen aufgeklebte Block in den Objekthalter fest eingespannt. Am Messerschlitten wird das Messer in entsprechender Weise befestigt. Über die Stellung des Messers, welche sich je nach dem Objekt, der Einbettungsmasse usw. ändert, vgl. auch §253 f. Alle Schrauben müssen fest angezogen werden, so daß Objekt und Messer unbeweglich mit ihren Schlitten verbunden sind. Jetzt wird das Objekt so weit gehoben, bis die nach oben gerichtete Seite desselben möglichst genau in der Messerhöhe liegt. Sodann zieht man das Messer versuchs- weise über das Objekt hinweg, wobei man den Objekt- schlitten allenfalls noch ein bißchen vor- oder zurück- schiebt, bis das Messer eben in die oberste Blockschicht einschneidet. Grundregel ist: Niemals dürfen mit dem Mikrotommesser dicke Scheiben abgeschnitten werden. Will man z. B. einen Teil des durchtränkten Stückes entfernen, um aus der Mitte des Objektes Schnitte zu bekommen, so geschieht dies entweder mit einem ge- wöhnlichen scharfen Messer, oder man schneidet mittel- dicke Scheiben allmählich mit dem Mikrotommesser ab, indem man den Objekt schütten nach jedem Schnitt um Bruchteile eines Millimeters vorschiebt, so lange, bis die gewünschte Schicht erreicht ist. v Romeis, Taschenb. d. mikrosk. Technik. 8. Aufl. 5 66 Das Mikrotom. §258^ Ist so in richtiger Schnitthöhe eingestellt, so wird mit einem Messer von den Rändern des Paraffinblockes das überflüssige Paraffin weggeschnitten, etwa so weit, bis das Objekt nur mehr von einem ca. 2 — ^3 mm breiten Mantel umgeben ist. Zweckmäßig gibt man dem Block hierbei eine rechteckige Form, wobei die Längsseiten parallel zur Schlittenbahn stehen. Nun wird der Mikrometer- schraubenschlitten dem Objektschlitten so weit genähert, bis die Spitze der Mikrometerschraube den Objektschlitten berührt, und sodann der erstgenannte mittels der seitlichen Klemmschraube festgeschraubt. Beim Schneiden zieht die rechte Hand den Messer- schlitten gleichmäßig an dem seithch angebrachten Hand- griff die Schlittenbahn entlang. Niemals darf von oben her auf den Schlitten gedrückt werden, da sonst die zwischen Schlitten und Schlittenbahn befindliche Ölschicht verdrängt wird und Schneiden und Schnitt unregelmäßig werden. Die linke Hand führt einen Pinsel, um den Schnitt während des Schneidens am Aufrollen zu verhindern. Die Pinselhaare feuchtet man zweckmässig etwas an, aber nicht mit Speichel, wie man häufig sieht, sondern mit Wasser oder schwachem Alkohol. Man nimmt am besten einen flachen Marderhaarpinsel. Nun wird das Objekt durch Drehen der Mikrometer- schraube um einen bestimmten Betrag gehoben. Anfänger beginnen wohl am besten mit 15 [x dicken Schnitten, all- mählich lerne man dann auch 10 /^ und dünner schneiden. Sodann zieht man langsam den Messerschlitten durch die Bahn. Sobald das Messer in den Block einschneidet, hält man die sich gewöhnlich nach aufwärts biegende Ecke des Schnittes mit der Pinselspitze frei in der Luft fest, ehe er sich aufzurollen beginnt. Der Schnitt darf nicht an das Messer angedrückt werden, da er sonst festklebt und beschädigt wird. Ebensowenig dürfen die Pinselhaare unter das Messer kommen, da dadurch die Schneide be- schädigt wird. Durch Übung wird man der anfänglichen Schwierigkeiten leicht Herr. Ist so der Schnitt gelungen, dann wird er mit dem Pinsel vom Messerrücken her gegen die Schneide zu vom Messer abgenommen, um weiter behandelt zu werden. Hierauf wird der Messerschlitten zurückgeführt, und zwar durch die ganze Bahn, um eine ungleichmäßige Abnut- zung der Schienen zu vermeiden. • §259—261. Spezielle Bemerkungen. 61 Hat man eine Zeitlang geschnitten, so wird die Mikro- meterschraube ihre ganze Bahn durchlaufen haben und muß wiederum zurückgedreht werden. Sodann wird die seit- liche Klemmschraube gelöst, der Mikrometerschrauben- schlitten in der früher angegebenen Weise wieder vorsichtig an den Objektschlitten herangeschoben, bis ihn die Spitze der Mikrometerschraube wieder berührt, seitlich festge- klemmt usw. Der Objektschlitten darf währenddessen nicht bewegt werden. Spezielle Bemerkungen. 259. In Paraffin eingebettetes Material schneidet man mit trockenem Messer. Ist das Paraffin zu weich, dann schiebt sich der Schnitt stark zusammen, ist es zu hart, dann rollt es sich oder es zerfällt in kleine Splitter. Im er- steren Fall kühlt man den Block, wenn man nicht vorzieht, ihn in härteres Paraffin umzubetten; im letzteren kann man sich häufig dadurch helfen, daß man dünner schneidet und den Block vor jedem Schnitt anhaucht. Wenn die un- tere Schneidefacette des Messers zu steil steht, werden die feineren Zellstrukturen leicht zertrümmert, ohne daß die äußere Form des Schnittes wesentlich beeinflußt zu sein braucht. Scharten der Messerschneide rufen im Schnitt längsverlaufende Streifen oder Risse hervor. Auch im Paraffin oder Objekt selbst gelegene Kalkkonkremente, Sandkörnchen od. dgl. können solche Erscheinungen her- vorrufen. Schneidet sich das Paraffin bröselig und schmie- rig, so enthält es noch Reste des Intermediums oder gas- förmige Bestandteile (vgl. auch § 218). Milchige, sich schlecht schneidende Stellen im Objekt selbst sind auf unzurei- chende Entfernung des Wassers, des Alkohols oder des In- termediums zurückzuführen. Größere Luftblasen im Ob- jekt lassen sich nachträglich mit einigen Tropfen heißen -Paraffins leicht ausfüllen (ev. Nachhelfen mit einer erwärm- ten Nadel). 360. Beim Schneiden von Alkohol- Celloidin muß sowohl Block wie Messerfläche mit 70%igem Alkohol gut befeuchtet werden, den man mit einem weichen Pinsel aufträgt. 361. Ölcelloidin nach Lee Wolfrum (§237), nach Apathy (§236) und Ölgelatine nach Apathy (§240) können trocken geschnitten werden. Man stelle das Messer nur halb so schräg wie bei Alkoholcelloidin. 5» 68 Das Gefriermikrotom. § 262—263. Für gewöhnlich schneidet man die nach Apathy in Ölcelloidin und Ölgelatine eingebetteten Objekte feucht, d. h. man bestreicht Schnittfläche des Blockes und Messer mit Terpineol, wobei man die unbenutzten Teile des Messers mit etwas Vaseline abdeckt. Das Gefriermikrotom. 262. Das Gefriermikrotom hat sich insbesondere, seit man statt Atherdämpfen flüssige Kohlensäure in be- quemer Weise zum Gefrieren der Präparate verwenden kann, zu einem vielfach unentbehrlichen Hilfsmittel der Mikrotechnik entwickelt. Der Vorteil der Methode liegt darin, daß sich von frischem oder fixiertem Material unter Abb. 1. Gefriermikrotom 'von Becker- Sartorius. Vermeidung einer Alkohol- usw. Behandlung Schnitte fewinnen lassen, was besonders bei Untersuchungen auf ett und Lipoide von großer Bedeutung ist. Ganz beson- deren Wert hat die Methode außerdem für praktische Zwecke (Schnelldiagnose, rasches Verarbeiten von umfangreichem Material usw.). 263. Von den vorhandenen Konstruktionen ist das Jungsche Studentenmikrotom und besonders das Gefriermikrotom von Becker-Sartorius, Göttingen, empfehlenswert (vgl. Abb. 1). § 264. Das Gefriermikrotom. 69 Gebrauch: Man bringt das zu untersuchende Or- gan aus physiologischer Kochsalzlösung (wenn frisch) oder aus destilliertem Wasser (wenn fixiert) auf den un- terhöhlten Halter des Objekttisches o. Große Objekte schneide man vorher in 0,5 — 1 cm dicke Scheiben. Neben dem Mikrotom steht in einem Ständer eine nach abwärts gekehrte Kohlensäurebombe, die durch einen Schlauch mit dem Objektträger des Mikrotoms verbunden ist. Hat man das Ventil v geöffnet, so strömt beim Öffnen des Hebels h Kohlensäure gegen die Unterfläche des Objekt- tisches und bringt das auf demselben liegende Objekt zum Gefrieren. Man läßt die Kohlensäure nicht konti- nuierlich, sondern immer nur momentweise durch ruck- weises Öffnen des Hebels ausströmen, so lange bis das leicht angedrückte Präparat, das man durch Auf tropfen von Wasser in einen Eismantel eingeschlossen hat, völlig durch- gefroren ist. Dann bringt man die Objektoberfläche durch Drehen der Kurbel k nach Ausschalten der Mikrometer- hebung in die Höhe des in den Messerhalter m fest einge- schraubten Messers. Hierauf stellt man in der Skala s auf die gewünschte Schnittdicke ein (anfangs etwa 20//) und schlägt nun den Messerhalter in raschen, gleichmäßigen Zügen vor und zurück, wobei man ihn immer bis an die Ansschlagzapfen durch die ganze Bahn hindurchführt. Bei jedem Schnitt wird das Objekt automatisch um die eingestellte Mikrenzahl gehoben. Man schneidet mit trocke- nem Messer. Die Schnitte läßt man entweder in eine vor- gehaltene, mit Wasser gefüllte Schale springen, oder man streicht sie, wenn sie am Messer kleben, mit einem Pinsel oder der Fingerkuppe vom Messer und taucht sie in Wasser, in dem sie sich ausbreiten. Um gute Schnitte zu bekommen, darf das Prä- parat weder zu stark noch zu schwach gefroren sein. Im ersteren Fall zerfällt der Schnitt in kleine Splitter und das Messer bekommt leicht Scharten, im letzteren Fall wird das Präparat gequetscht und nicht geschnitten. Ist es zu stark gefroren, so wartet man kurze Zeit, bis das Präparat durch Auftauen die richtige Härte erreicht hat. Bei einiger Übung erhält man leicht 10 jli Schnitte. 264. Zum Auffangen der Schnitte nehme man de- stilliertes oder ausgekochtes Wasser, um das Entstehen und Ansetzen von Luftblasen zu vermeiden. Kommt der Nachweis von Fettsubstanzen nicht in Frage, so fängt 70 Das Aufkleben der Schnitte. § 265—266. man in 70% Alkohol auf, durch den die Färbbarkeit der Schnitte vielfach gebessert wird. 265. Frische Präparate schneiden sich häufig schlecht, besonders wenn sie fetthaltig sind. Derartige Schnitte breiten sich auch nur unvollkommen aus. Wenn irgend möglich, fixiere man daher die Präparate vorher in Formol (1:10 oder 1:4) oder Orth scher Lösung. Der- art fixiertes Material schneidet sich ausgezeichnet. He- dinger empfiehlt, die 24 Stunden oder länger in Formol fixierten Präparate auf 24 Stunden in 96% Alkohol zu übertragen, dann auf einige Stunden in Formol zurück- zubringen und hierauf mit dem Gefriermikrotom zu schnei- den. (Bei Untersuchungen auf Fett und Lipoide ist die Alkoholbehandlung natürlich nicht anwendbar.) Präparate, die vorher in Alkohol lagen, müssen vor dem Gefrieren zur Entfernung des Alkohols mehrere Stun- den in Wasser oder 4% -Formollösung gelegt werden, da sie andernfalls nicht durchfrieren. Material, das in sublimathaltigen Flüssigkeiten fixiert wurde, eignet sich zur Herstellung von Gefrierschnitten weniger. Über die Weiterbehandlung der Schnitte siehe § 312 u. §313. 7. Kapitel. Das Aufkleben der Schnitte. A. Allgemeine Bemerkungen. 266. Um eine Beobachtung des Schnittes zu ermög- lichen, ist es in vielen Fällen, immer aber bei Paraffin- ßchnitten, nötig, das Einbettungsmittel wieder zu ent- fernen. Dadurch verlieren die meisten Schnitte ihren Zusammenhalt. Schon deshalb ist es zweckmäßig, die Schnitte vor der Weiterbehandlung auf dem Objektträger zu befestigen: aufzukleben. Dies bietet u. a. auch den Vor- teil, daß man eine große Anzahl von Schnitten gleichzeitig und daher rascher und zudem gleichmäßiger behandeln kann. Unerläßlich ist das Aufkleben, wenn es sich um An- fertigung sog. Schnittserien z. B. für embryologische Un- tersuchungen oder für Rekonstruktionen handelt. Man hat beim Serienschneiden darauf zu achten, daß kein Schnitt verloren geht; ist dies dennoch geschehen, so ist es sofort zu notieren (etwa so, daß man im Serienkatalog einträgt: Serie 1, Objektträger 1, Schnitt 3 fehlt, oder dadurch, daß man auf dem Objektträger an Stelle des verlorenen Schnittes eine Lücke läßt.) Il Si 1 1 2 6 3 7 'r 8 -* ♦ + i >r 1 § 267—272. Aufkleben von Paraffinschnitten. 74 267. Man gewöhne sich von Anfang an, beim Aufkleben mehrerer Schnitte oder Serien die Schnitte in ganz be- stimmter Ordnung aufzulegen. Für Serienschnitte erwies sich mir die in Fig. 2 gezeichnete Ordnung als die F'^- 2. zweckmäßigste. 268. Die zur Bezeichnung des Objektträgers notwen- digen Zeichen (Protokollnummer, Reihenfolge, Diagnose usw.) bringt man gewöhnlich auf seiner rechten Seite an. Man bedient sich dazu eines Schreibdiamantens. Weniger sind die käufHchen Glastinten zu empfehlen. Zur vorübergehen- den Bezeichnung kann man einen Fettstift benutzen. 269. Kann man die Bezeichnung bereits vor dem Auf- kleben der Schnitte vornehmen, so empfiehlt sich folgende, von V. Apathy angegebene Methode i). Man mischt flüssige schwarze Tusche (z. B. Pelikantusche) mit gleichen Teilen Eiweißglyzerin (vgl. § 278). Mit dieser Schreib- flüssigkeit, welche gut verschlossen, jahrelang haltbar ist, bezeichnet man den fettfrei gereinigten Objektträger. Hierauf erhitzt man die betreffende Stelle über einer Flamme, bis weißliche Dämpfe aufsteigen; die Schrift- zeichen sind dann auf dem Glas sehr fest fixiert. Das Be- schriften und Erhitzen ist am besten vor dem Auflegen der Präparate vorzunehmen. :^ 270. Wird die Bezeichnung dagegen erst nach Fertigstellung des Präparates angebracht, so überstreicht man die betreffende Stelle des Objektträgers in dünner Schicht mit einer verdünnten Lösung von 1 ccm des ge- wöhnlichen Kanadabalsams in 10 ccm Benzol. Man kann dann an dieser Stelle sehr gut mit Tinte oder Tusche schrei- ben. In Benzol, Alkohol usw. löst sich die Schrift jedoch. 271. Je nach dem Einbettungsmittel wurden ver- schiedene Verfahren zum Aufkleben der Schnitte ersonnen. Von den zahlreichen Methoden wähle ich im nachfolgenden hauptsächlich jene aus, die bei möglichst einfacher Technik zuverlässige Resultate geben. B. Aufkleben von Paraffinschnitten. a) Methoden mit Wasser. 272. Die einfachste Methode ist das Aufkleben mit Wasser (destilliertes Wasser, manche bevorzugen Brunnen- ^) Ich verdanke diese Angabe, wie auch die in § 282, 3 angegebene Methode einer brieflichen Mitteilung v. Apathys. 72 Aufkleben von Paraffinschnitten. § 273 — 27ö. wasser) oder 30% igen Alkohol. Das Haften der Schnitte erfolgt dabei durch Kapillarattraktion. Man legt die Schnitte so auf den Objektträger, daß die dem Messer zugekehrte, glänzende Fläche des Schnittes auf das Glas zu liegen kommt. Zur Vermeidung von Mißerfolgen (z. B. Loslösen der Präparate beim Färben usw.) ist es nötig, absolut reine Objektträger zu verwenden. (Reinigung siehe §37.) 273. Nehmen die Objektträger das Wasser nicht gleich- mäßig an, so ist das meist ein Zeichen dafür, daß sie nicht ganz fettfrei sind. Man wasche sie dann mit Kaliseife, spüle sie gut mit Wasser ab und lege sie nach Abtrocknen auf einige Stunden in die in § 39 angegebene Flüssigkeit. Hilft auch das nicht, dann putze man sie mit etwas feiner Schlemmkreide. Mit Osmiumsäure oder Osmiumgemischen fixierte Präparate lassen sich mit reinem Wasser nur unsicher aufkleben. 274. Ausführung: Man zieht auf einem sehr sorgfältig gereinigten Objektträger mit einem in destilliertes Wasser getauchten Pinsel einen schmalen Wasserstreifen. Auf diesen legt man der Reihe nach die Paraffinschnitte auf, so daß die Ränder der am besten rechteckigen Schnitte dicht aneinanderliegen. Ist eine Reihe fertig, so zieht man dicht anschließend mit dem Pinsel einen zweiten Wasser- streifen, legt wieder die Präparate auf usf. Dabei nehme man, um ein Auseinanderschwimmen der Präparate zu vermeiden, immer nur wenig Wasser. Anderseits muß man, zumal beim Serienschneiden, so lange bis man mit dem Auflegen der Präparate fertig ist, durch zeitweises Zufügen von Wasser ein Verdunsten der Wasserschicht hintanhalten. Man fügt das Wasser nicht vom Rande her zu, sondern in der Weise, daß man einen Wassertropfen zwischen zwei Paraffinschnitte fallen läßt. Hat man die gewünschte Anzahl von Schnitten aufgelegt, dann setzt man mit dem Pinsel oder einer Pipette nochmal etwas Wasser zu und erwärmt den Objektträger vorsichtig über einer kleinen Flamme auf etwa 30 — 35" C, wobei sich die Schnitte glatt ausdehnen. Ein Schmelzen des Paraf- fins durch zu starkes Erwärmen (starke Schrumpfungen der Zellstrukturen!!) ist peinlichst zu vermeiden. Sind die Schnitte glatt, dann läßt man sie nach Ablaufen des überflüssigen Wassers vor Staub geschützt an der Luft oder in einem Thermostaten bei 30 — 35^ C 24 Stunden lang gut trocknen. (Thermostat nicht unbedingt nötig.) 275. Das Erwärmen des Objektträgers kann man auch auf einem sog. Wärmetisch (s. Fig. 3) vornehmen, es läßt sich so das Schmelzen des Paraffins leichter vermeiden. Die Tisch- § 276—279. Aufkleben von Paraffinschnitten. 73 platte dieses gewöhnlich aus Eisenblech gefertigten Gestelles ist an der einen Schmalseite in der gezeichneten Weise auf- gebogen; durch eine darunter gestellte Flamme läßt sich dann die Temperatur der Tischplatte selbst beliebig regulieren. Den mit den Schnitten beschickten Objektträger legt man auf eine etwa 30 — 35"C warme Stelle der Tischplatte. Die Schnitte breiten sich dann in kurzer Zeit ganz glatt aus, worauf man das überflüssige Wasser ablaufen läßt. Fig. 3. Wärmetischchen nach G. Born (verkleinert 1 : 5). 276. Einzelne Paraffinschnitte kann man auch direkt vom Mikrotom in eine Schale mit lauwarmem Wasser (ca. 35'') übertragen und auf der Wasseroberfläche schwimmen lassen, wobei sie sich glatt strecken. Man benutze dazu ausgekoch- tes destilliertes Wasser, um das Auftreten lästiger Luft- blasen zu vermeiden. Man fängt die Schnitte dann mit fettfrei geputzten Objektträgern auf und läßt sie antrocknen. (Siehe ferner auch § 282.) Dieses Verfahren ist besonders für große Schnitte empfehlenswert! ß) Methoden mit Eiweiß. 277. Sicherer als das Aufkleben mit reinem Wasser ist das von P. Mayer (83) eingeführte Aufkleben mit Eiweiß, -das besonders in der Kombination mit Wasser (siehe § 282) zu empfehlen ist (insbesondere bei Chrom- präparaten, die leicht abschwimmen). 278. Herstellung der Eiweißlösung: Man schüttelt das Eiweiß eines frischen Hühnereies mit der gleichen Menge chemisch reinen Glyzerins gut durch und filtriert durch ein Faltenfilter. Um ein Faulen der nur sehr langsam filtrierenden Lösung zu verhindern, setzt man sowohl zur filtrierenden Flüssigkeit wie zum Filtrat sofort ein Stückchen Kampfer oder Thymol. Auch Formolzusatz (1:100) ist zu empfehlen. Das Eiweißglyzerin hält sich, gut verschlossen, lange Zeit. 279. Statt Hühnereiweiß kann man auch eine 10% ige wässerige Lösung von Serumalbumin (Albumin, puriss. aus 74 Aufkleben von Paraffinschnitten. § 280—282. Blut, Merck in Darmstadt) mit der gleichen Menge Glyzerins vermischen. 280. Trockene Aufklebemethode mit Eiweiß. Man bringt mittels eines Glasstäbchens einen kleinen Tropfen der Eiweißglyzerinlösung auf einen gut gereinigten Ob- jektträger und verreibt ihn mit der Fingerbeere oder einem feinen Leintuch in sehr dünner Schicht. Dann legt man den aufzuklebenden Paraffinschnitt mit der glänzenden Seite nach unten auf die so präparierte Schicht auf, drückt zunächst eine Ecke des Schnittes mit einem Pinsel fest an und streicht nun vorerst ganz leicht von dieser Ecke aus über den Schnitt weg, bis er sich geglättet und ent- rollt hat. Dann erst drückt man den Schnitt von allen Seiten her mit dem Pinsel fest an das Glas an, so daß sich schließ- lich zwischen Schnitt und Glas keinerlei Luftblasen mehr befinden (sind von der Glasseite her als glänzende Stellen sichtbar). Der Objektträger liegt dabei auf dem Tisch auf dunkler Unterlage. Nunmehr muß der Objektträger zur Koagulation der Eiweißschicht über einer kleinen Gas- oder Spiritus- flamme kurze Zeit erhitzt werden, bis das Paraffin eben geschmolzen ist. Zu starke Erhitzung ist zu vermeiden, da sonst das Präparat beschädigt wird. (Die Hitze des erwärmten Objektträgers muß beim Prüfen am Handrücken noch erträglich sein.) Derartig aufgeklebte Schnitte können dann ohne wei- teres Trocknen gleich weiterbehandelt werden. Die Methode arbeitet rasch und sicher; die Präparate haften fest und lösen sich nur in starken Säuren und Alkalien. Ein Nachteil ist, daß zarte und dünne Schnitte beim Auf- kleben leicht beschädigt werden, und daß sie sich unter Umständen schlecht ausbreiten lassen. 281. Zum Aufkleben wie auch zum Schneiden benutzt man flache Pinsel, am besten aus Marderhaaren. 282. Die obengenannten Fehler vermeiden die Eiweiß- wassermethoden (Henneguy, später Ikeda, daher sog. japanische Methode, und viele andere), die in zahlreichen Modifikationen existieren, wovon folgende empfohlen seien. 1. Man verreibt Eiweißglyzerin in dünner Schicht auf dem Objektträger und klebt die Präparate nach § 272 oder § 276 auf. Hierauf folgt mehrstündiges Trocknen im Ther- mostaten und endlich Koagulation der Eiweißschicht wie in § 280. § 283—285. Aufkleben von Paraffinschnitten. 75 2. V. Apathy (12) gibt auf die gut gereinigten Ob- jektträger etwas mit Eiweißglyzerin versetztes Wasser, legt die Schnitte auf, erwärmt sie, bis sie sich strecken, läßt den Überschuß der Flüssigkeit ablaufen und trocknet. (Eiweißglyzerinwasser: 1 Tropfen Eiweißglyzerin wird mit 4 ccm destilliertem Wasser geschüttelt.) 3. Ausgezeichnet, aber etwas umständlicher ist fol- gende Methode v. Apathy s (s. Anm. §269), Man verreibt einen Tropfen Eiweißglyzerins in ganz dünner Schicht auf einem Objektträger und erhitzt ihn mit der Schichtseite nach oben über einer nichtrußenden Flamme, bis weiß- liche Dämpfe aufsteigen. (Akroleingeruch.) Nach dem Abkühlen bringt man mit dem Pinsel etwas 30% Alkohol auf die präparierte Schicht, legt die Präparate auf, erwärmt und trocknet wie in § 274. Eine nachfolgende Koagulation durch Erhitzen ist hier unnötig. Bei Anwendung der letztgenannten Methode ist ein Loslösen der Schnitte außerordentlich selten, weshalb sie sehr empfohlen sei. Für gewöhnlich sind aber auch die etwas rascheren Methoden nach 1 und 2 wie auch nach § 274 hinreichend. 283. Paraffincelloidinschnitte werden nach einem der in §§ 274, 276, 280 oder 282 genannten Verfahren aufge- klebt. V. Apathy taucht kurze Zeit die Objektträger mit den auf- geklebten Schnitten in eine 0,5% Gelloidinlösung in Alkohol- Äther (3:1). Nach dem Trocknen weiterbehandeln wie ge- wöhnhch. y) Besondere Aufklebemethoden. 384. Besonders bröckelige, leicht abschwimmende Paraffinschnitte, wie z. B. von stark dotterhaltigen Em- bryonen oder von osmiertem Material, klebt man zunächst nach einer der in §282 genannten Methoden auf. Nach dem Trocknen wird das Paraffin zunächst durch Toluol gelöst. Dann kommen die Präparate für 2 — 3 Minuten in absoluten Alkohol, hierauf auf ca. 3 — 5 Minuten in eine ganz dünne etwa 0,5% -Lösung von Celloidin in Äther- Alkohol. Sodann läßt man die Lösung abtropfen und bringt die Präparate, bevor die Ätherlösung völlig verdunstet (Vorsicht!), in 70% Alkohol, in dem die äußerst dünne, die Präparate überziehende Celloidinschicht gehärtet wird; dann Wasser, Färbung usw. 285. Schnitte, die sehr angreifenden Prozeduren ausgesetzt werden (z. B. starken Säuren, Alkaüen, Verdauungsflüssig- 76 Aufkleben von Paraffinschnitten. § 286—287. keiten u. dgl.), empfiehlt Olt mit (telatine aufzukleben. Man löst dazu 10 g feinster Gelatine in 100 com destilliertem Wasser auf dem Wasserbad, setzt zur Klärung der Lösung das Eiweiß eines Hühnereies zu und kocht 10 Minuten unter Umrühren. Zum Filtrat der heißfiltrierten Lösung fügt man 10 com einer 5% Karbolsäurelösung. Zum Aufkleben löst man etwa 10 g dieser beim Abkühlen erstarrenden Masse unter leichtem Erwärmen in 100 ccm destilliertem Wasser und verwendet diese wie in § 272 und § 282 an Stelle des destillierten oder des Eiweißglyzerinwassers zum Aufkleben, wobei man zum Glätten der Schnitte auch erwärmen kann. Sodann saugt man den Überschuß an Flüssigkeit mit Filtrier- papier ab und bringt die Schnitte für 1 Stunde in eine gut ver- schlossene Glasdose oder in einen Exsikkator, auf dessen Boden ein Schälchen mit etwas 40% Formahn steht. Nach der Einwirkung der Formalindämpfe kommen die Ob- jektträger noch einige Minuten in 10% wässerige Formol- lösung. Sodann werden sie mit Filtrierpapier abgetrocknet und im Thermostaten getrocknet. Durch die Formalin- dämpfe wird die dünne Eiweißgelatineschicht so gehärtet, daß sich der Schnitt selbst bei Einwirken von Alkahen nicht mehr loslöst. Nachteihg ist, daß sich die Gelatine bei manchen Färbungen mitfärbt. Weitere Verwendung dieser Methode siehe §291. 286. Szombathy (17) empfiehlt: 1. Man löst 1 Teil Gelatine in 100 Teilen destilherten Wassers bei 40'' und fügt 1 Teil einer 2 % Karbollösung zu. Nach Abkühlen wird filtriert und 15 Teile Glyzerin zugesetzt. Damit klebt man auf wie mit Eiweißwasser. Dann 1 Stunde in Dose mit Formol- dämpfen. Oder: 2. Man verreibt etwas von obiger Gelatine- lösung auf dem Objektträger. Dann fügt man 1 Tropfen einer 2% Formaldehydlösung zu, breitet ihn aus, haucht an und klebt auf. Trocknen im Thermostaten. Oder 3. Auf- kleben mit 50 Teilen einer 1 Voigen Gelatinelösung und 50 Teilen einer 2% Formaldehydlösung. Im Thermostaten trocknen. Die Schnitte sollen sich auch in Alkalien nicht loslösen. Die Gelatine färbt sich nicht mit. Ich nehme als Ausgang die sterile 10% Gelatinelösung von Merck, die ich entsprechend verdünne. (Thymolzusatz.) 287. Sehr große oder viel Bindegewebe enthaltende Schnitte streckt Michaelis zunächst auf Wasser von 35 — 40" C, fängt sie mit dem Objektträger auf und drückt sie mit glattem Schreibpapier fest an denselben an. Dann zieht er das Papier mit dem anklebenden Schnitt ab, schneidet das- selbe dicht um denselben ab und klebt den Schnitt samt Papier unter festem Andrücken auf einen zweiten mit Eiweiß ench § 280 bestrichenen Objektträger. Sodann Koagulieren das Eiweißes durch Erhitzen usw. Beim Weiterbehandeln fällt das Papier ab. § 288—292. Aufkleben der Celloidinschnitte. 77 C. Aufkleben der Celloidinschnitte. 288. Methode von Rubaschkin (07), Dantschakoff (08), (russische Methode). Nach der letzten Modifikation von Maximow (09) entfaltet man zunächst die in 70% Alkohol geschnittenen Schnitte auf dem Messer und über- trägt sie auf dem Spatel mit möglichst wenig Alkohol auf einen mit Eiweiß- Glyzerin (2:1) beschickten Objekt- träger, preßt sie hier nach völligem Glätten mit mehrfach gefaltetem glatten Filtrierpapier an und übergießt sie mit reinem englischen Nelkenöl. Sind die Schnitte ganz aufgehellt (ca. 5 — 20 Minuten), so wird dieses abgegossen und der Objektträger in 95% oder absoluten Alkohol gestellt; nach 5 — 10 Minuten in eine 2. und 3. Küvette mit absolutem Alkohol, ev. zur völligen Lösung des Gelloidins in Äther- Alkohol. Dann 70% Alkohol usw. 289. Nach meinen Erfahrungen lassen sich derart 5 bis 12 jU dicke Schnitte sicher aufkleben, dickere Schnitte (15 ^ und mehr) schwimmen dagegen leicht ab. Die Methode läßt sich auch für Ölcelloidinschnitte verwenden. Man bringt die trocken oder unter Öl geschnittenen Schnitte zunächst in 90% Alkohol, ordnet sie auf den Objektträger, preßt mit Filtrierpapier an usw. Statt Nelkenöl kann man auch Methyl- benzoat nehmen (vgl. § 309). Anitschkow (10a) bringt die Schnitte nach der Nelkenölbehandlung statt in Alkohol in Azeton, dann 70% Alkohol, Wasser usw. 290. Nach der italienischen Methode (Garazzi) bringt man die Serienschnitte zunächst vom Messer auf alkohol- befeuchtete {10%) Klosettpapierstreifen, wo man sie ordnet. Dann legt man den Papierstreifen, der nicht zu feucht sein darf, auf den Eiweißobjektträger und preßt die Schnitte fest auf. Dann vorsichtiges Abheben des Papiers, 96% Al- kohol, Nelkenöl, absoluten Alkohol usw. 291. Die Olt'sche Methode (s. §285) führt man bei Gelloidinschnitten folgendermaßen aus: Man verreibt auf dem Objektträger mit dem Finger ein kleines Stückchen der Eiweißgelatine, legt auf die so präparierte Oberfläche den in 60% Alkohol aufgefangenen geglätteten Gelloidinschnitt, wobei man möglichst wenig Flüssigkeit mit überträgt, drückt den Schnitt mit glattem FUeßpapier gut an und setzt den Objektträger wie in § 285 Formoldämpfen aus. Dann in Wasser usw. oder wenn das Gelloidin gelöst werden soll, durch 80% Alkohol in Äther-Alkohol usw. 292. Eine von Weigert (85) besonders für das Zentral- nervensystem und namentlich für große Schnitte ausgear- beitete Methode läßt auch die Behandlung vieler Zelloidin- schnitte auf einmal zu. Die Schnitte werden mit Streifen aus ungeleimtem Papier (sog. Klosettpapier) in einer bestimmten Reihen- 78 Aufkleben der Gelloidinschnitte. § 293. folge aufgefangen, indem man das Papier auf die auf dem Messer befindlichen Schnitte legt; sie bleiben daran haften, und das Papier kann behutsam mit dem Schnitt abgenom- men werden. Damit der Papierstreifen samt den Schnitten nicht trocknet, legt man ihn, wälirend man den nächsten Schnitt anfertigt, auf eine mit 70% - Alkohol befeuch- tete Lage von Fließpapier; mit dem nächsten Schnitt wird in derselben Weise verfahren, bis man eine gewisse Anzahl von Schnitten in einer gewünschten Reihenfolge auf dem Papier erhalten hat. Es wird nun auf einer entsprechend großen Glasplatte dünnflüssiges Kollodium (welches man evtl. mit Schwefel- äther nach Wunsch verdünnen kann) nach Art, wie es die Photographen tun, ausgebreitet. Wenn die Kollodium- ßchicht trocken geworden ist (ein paar Minuten genügen), drückt man die Schnitte, indem man über die Papierfläche vorsichtig mit der Hand streicht, an die dünne Kollo- diumschicht an. Das Papier kann nun vorsichtig abge- zogen werden, die Schnitte bleiben an der Kollodiumfläche in der Regel haften. Dieselben dürfen nicht eintrocknen und müssen deshalb mit 70% - Spiritus feucht gehalten werden. Es wird eine zweite Kollodiumschicht in einer ähnlichen Weise wie die erste auf der Glasplatte mit den Schnitten, die man zuvor mit daraufgelegtem Fließ- papier getrocknet hat, ausgebreitet. Ist diese zweite Schicht ebenfalls trocken geworden, so muß man die Platte samt den Schnitten sofort in die Farbe übertragen, wo die Schnitte mit der Kollodiumschicht von der Glasplatte abgehen und miteinander weiter behandelt werden können. Vor dem Einschließen kann man die Kollodiumplatte mit der Schere beliebig zuschneiden und so, wenn nötig, einzelne Schnitte isolieren. 293. v. Apathy bringt die unter Terpineol geschnitte- nen ölparaffin-, Ölcelloidin- oder Ölgelatineschnitte zunächst auf ein glattes, mit Terpineol befeuchtetes, signiertes Ziga- rettenpapier (Grundblatt); darüber kommt dann ein zweites, geöltes Deckblatt. Die Schnitte können so zunächst unauf- geklebt aufbewahrt werden. Zum Aufkleben legt man das Ganze mit dem Deckblatt nach unten auf eine Glasplatte, legt ein trockenes Zigarettenpapier auf und streift mit gelin- dem Druck darüber. Wenn sehr feucht, wiederholt man diesen Vorgang mit neuem Papier nochmals. Dann faßt man das über den Schnitten liegende Papier an einer Ecke und rollt es sorgfältig ab, wobei die Schnitte auf dem früheren Deck- blatt haften bleiben. (Bleiben sie am abzunehmenden Blatt kleben, so ist es ein Zeichen, daß das Papier zu trocken war, §294—296. Die Weiterbehandlung der Schnitte.; 79 man feuchte es dann vorher mit Terpineol etwas an.) Nun- mehr wird das Papier mit den Schnitten nach unten auf einen mit Eiweiß bestrichenen Objektträger (siehe § 280) gelegt und hier abgeklatscht. Dann legt man ein trockenes Zigarettenpapier auf, darüber einen Objektträger und bringt das Ganze auf eine auf mindestens 65^ C erwärmte Metall- platte, drückt mit dem Finger etwas auf den oberen Objekt- träger und wartet, bis auch dieser die genannte Temperatur angenommen hat, was rasch geschieht. Zur Not kann das Erwärmen auch über einer Flamme vorgenommen werden (das Papier darf aber nicht Feuer fangen). Dann stellt man die Objektträger, ohne sie zu verschieben, noch warm, schief in Chloroformalkohol {aa) in der Weise, daß der die Schnitte tragende Objektträger der untere ist. Nach ein paar Minuten kann man die Objektträger auseinandernehmen, wobei sich das Papier von selbst ablöst. Falls nötig, kann man dann das Celloidin durch absoluten Alkohol noch lösen usw. Will man Alkoholcelloidinschnitte nach dieser Methode aufkleben, so muß man in 90% Alkohol schneiden (geht höchstens 1 Stunde lang, dann wieder härten in 70% Alkohol), in Bergamottöl strecken, von hier auf Zigarettenpapier auffangen, mit Ter- pineol befeuchtetem Deckblatt bedecken usw. (Weitere Ein- zelheiten siehe in der Originalarbeit.) Die Schnitte müssen also bei Anwendung der Apathyschen Aufklebemethode ent- wässert werden, da sonst beim Erhitzen sehr starke Schrump- fungen eintreten. D. Aufkleben der Gefriersdinitte. 294. Anitschkow (10b) fängt Gefrierschnitte aus 50% Alkohol auf den frisch mit Eiweißglyzerin bestrichenen Objektträger heraus, tropft den Alkohol ab, glättet die Schnitte mit glattem, mehrfach gefaltetem Filtrierpapier und taucht zur Gerinnung % Minuten in 98% Alkohol, dann 70% igen usw. (Wenn hernach Fettfärbung beabsichtigt ist, nimmt man statt 98% Alkohol eine Mischung von 50% Alkohol und Formalin (50:7,5; 1 Minute), dann Wasser.) 296. Bei Anwendung der Oltschen Gelatinemethode bringt man die Gefrierschnitte zunächst in die § 285 angegebene Lö- sung von 10 g Eiweißkarbolgelatine in 100 ccm Wasser und fängt sie auf dem Objektträger auf. Dann saugt man den Überschuß an Flüssigkeit ab und härtet in Formoldämpfen. 8. Kapitel. Die Weiterbehandlung aufgeklebter und unaufgeklebter Schnitte. A. Paraffinschnitte. 296. Die aufgeklebten Paraffinschnitte bringt man zur Paraffinbefreiung auf kurze Zeit (2 — 5 Minuten 80 Weiterbehandlung der Paraffinschnitte. § 297—299. oder länger) in eines der in § 198 angegebenen Lösungs- mittel, z. B. in Xylol oder Toluol. Ist das Präparat schon gefärbt und nur mit Wasser aufgeklebt, so kann es nach dem Entparaffinieren direkt in Kanadabalsam (§ 381 f.) einge- schlossen werden. Soll es erst noch gefärbt werden, dann muß zunächst das Lösungsmittel durch absoluten Alkohol entfernt werden. Aus diesem kommt es dann in 80% Alkohol und von hier in Wasser. 297. Als Gefäße benutzt man dazu zweckniäßig die in Fig. 4 abgebildeten zylinderförmigen Gläser mit Über- falldeckel; um das Umfallen zu er- schweren, stellt man sie in einen ent- sprechend ausgebohrten Holzblock. Fig. 5 zeigt im Grundriß, wie man 6 Objektträger (je 2 mit der freien Fläche aneinandergelehnt) in einem solchen Glase unterbringen kann, ohne daß sich die aufgeklebten Schnitte berühren. Fig. 4. Färbeglas, verkleinert Va- Fig. 5. Grundriß zum Färbe- glas, natürliche Größe. 298. Viel im Gebrauch sind auch die meist 10 — 20 Ob- jektträger fassenden Glas- oder Porzellantröge mit Rillen. Die gleichzeitige Behanddlung von 36 Objekt- trägern ermöghcht ein von Hauser angegebenes Metall- gestell, das in entsprechend große, Glaströge gestellt wird) (erhälthch bei Wagner nnd Münz, München Karlstr. 43). Neumayer gibt eine reifartige Vorrichtung an, die die gleich- zeitige Behandlung von 100 — 200 Objektträgern in großen runden Glasschalen ermöghcht. 299. Mit Eiweißglyzerin aufgeklebte Paraffinschnitte dürfen nach dem Lösen des Paraffins in Toluol i) nicht 1) Der Einfachheit halber nenne ich hier und im folgenden nur eines der geeigneten Lösungsmittel, statt Toluol kann man natürhch auch Benzol oder Xylol nehmen. § 300—303. Weiterbehandlung der Paraffinschnitte. 81 direkt in Balsam eingeschlossen werden, sondern müssen vorher stets noch in absoluten Alkohol kommen, um das Glyzerin zu entfernen. Man hat sonst vielfach mit schlech- ten Resultaten zu kämpfen, da sich das dem Aufklebe- eiweiß beigemengte Glyzerin mit Toluol, Xylol usw. nicht mischt und dadurch Flecken erzeugt. 300. Beim Übertragen des Objektträgers von einer Flüssigkeit in die andere lasse man die Flüssigkeiten gut abtropfen, um die nächstfolgende möglichst wenig mit der vorausgehenden zu verunreinigen. Dabei dürfen aber die Prä- parate unter keinen Umständen austrocknen, was besonders, wenn sie aus leichtflüchtigen Medien, wie Toluol, Äther u. dgl. genommen werden, sehr leicht eintritt. Man er- kennt das Austrocknen am Weißlichwerden des Präparates, 301. Nach dem Färben (siehe Kapitel 9) müssen die Präparate, falls sie in Kanadabalsam eingeschlossen werden sollen, wieder zurück in Toluol gebracht werden. Dazu müssen sie peinlichst entwässert werden, da durch zurückbleibende Wasserteilchen Trübungen hervorgerufen werden. Die Präparate kommen daher zunächst in 70- oder 80% -Alkohol, in 96% und dann in absoluten Alkohol, aus dem sie in Toluol o. dgl. übertragen werden. Treten dabei milchige Trübungen auf, so ist es ein Zeichen dafür, daß nicht genügend entwässert ist. Die Präparate kommen dann nochmals in den absoluten Alkohol zurück. Bei sehr empfindlichen Präparaten nimmt man am besten 2 — 3 Gläser mit absolutem Alkohol und ebenso viele Portionen Toluol. 302. Um gebrauchtes Toluol zu reinigen, versetzt man es zur Hälfte mit Schwefelsäure, schüttelt durch und trennt. Die Säure wird mit Soda abgestumpft, 20 g Tierkohle auf 1 1 Toluol zugesetzt und durch Faltenfilter filtriert. 303. Weiterbehandlung unaufgeklebter Paraffinschnitte. Man bringt die Schnitte direkt vom Mikrotom in ein Schäl- xhen mit Toluol und löst das Paraffin. Soll dann gefärbt werden, so überträgt man den Schnitt mit Spatel und Nadel oder mit einem Objektträger in absoluten Alkohol, sodann in 80% und schließlich in Wasser. Bei zarten Schnitten schaltet man evtl. noch 96%, 70%, 60% und 45% Alkohol dazwischen. Nach dem Färben bringt man den Schnitt in umgekehrter Reihenfolge wieder in das Toluol zurück. Dabei achte man besonders beim Übertragen in die höher- prozentigen Alkohole und in Toluol, daß der Schnitt glatt auf dem Spatel liegt, da sonst schwer entfernbare Falten entstehen. Um Schrumpfungen zu vermeiden, empfiehlt Romeis, Taschenb. d. mikrosk. Technik. 8. Anfl. 6 82 Weiterbehandlung der Gelloidinschnitte. § 304—308. es sich, bei unaufgeklebten Schnitten oft, zum Entwässern statt absolutem Alkohol Karbolxylol (1:3) oder besser Terpineol (vgl. § 307) zu verwenden. Im allgemeinen ist das Aufkleben der Paraffinschnitte vorzuziehen. 304. Die Flüssigkeiten füllt man am besten in Schalen mit gut eingeschhffenem Rillendeckel. Man nehme sie nicht zu klein, da sonst das Auffangen der Schnitte auf den Objekt- träger unnötig erschwert wird (ca. 6—8 cm Durchmesser). 305. P. Mayer empfiehlt, das Paraffin vor der Fär- bung in bestimmten Fällen nicht zu lösen. Dasselbe macht die unaufgeklebten Schnitte gegen Verletzungen wider- standsfähiger. Man bringt die Schnitte vom Mikrotom auf die schwach erwärmte (30—35** C) Farblösung und läßt sie hier schwimmen. Sie legen sich bald glatt und färben sich sehr gut, wenn auch etwas langsamer. Nach vollendeter Färbung werden sie gut gewaschen und mit Wasser oder Eiweißglyzerin aufgeklebt, wobei man einen Überschuß an Wasser mit Filtrierpapier absaugt. Nach dem Trocknen Weiterbehandlung wie in §296. Diese wichtige Beobachtung, daß Paraffinschnitte schon ohne Lösung des Paraffins für wässerige Lösungen permeabel sind, kann mit kleinen Modifikationen in verschiedenen Fällen nutzbar gemacht werden, so beim Färben von Material, das sich beim Aufkleben nur schwer glatt legt, wie z. B. Ossi- fikationen, Gefäße; oder bei Behandlung mit Verdauungs- flüssigkeiten, mit Silbernitrat usw. B. Gelloidinschnitte. 306. Alkoholcelloidinschnitte werden meist unauf- geklebt weiterbehandelt, da das Gelloidin häufig nicht entfernt zu werden braucht und den Schnitt vor Beschädi- gung schützt. Die Schnitte, welche vom Schneiden her mit 70% Alkohol benetzt sind, kommen zunächst in Wasser, werden gefärbt und müssen nun entwässert werden. Man bringt sie mit Nadel und Objektträger in 80 und 96%- Alkohol, sodann zur völligen Entwässerung in Karbolxylol (1:3), reines Xylol und Balsam. 307. Statt Karbolxylol, das besonders für viele Anihn- farben schädlich ist, nimmt man besser Terpineol, das Gelloi- din nicht löst und die Farben nicht angreift. Auch Bergamott- öl, Zedernöl, Origanumöl oder synthetische Flüssigkeiten, wie Euparal, können verwendet werden. Nach dem Öl kommen die Schnitte noch in Xylol o. dgi., dann in Balsam s. a. §190. 308. Unaufgeklebte Schnitte von Ölcelloidin bringt man, wenn das Gelloidin erhalten werden soll, auf kurze Zeit in 96% Alkohol, dann 80% und Wasser usw, § 309—312. Weiterbehandlung der Gefrierschnitte. 83 309. Nelkenöl löst Celloidin auf. P. Mayer {16b) emp- fiehlt als Ersatz des unangenehm riechenden teuren Nelkenöls, das auch für viele Färbungen schädlich ist, Methj'lbenzoat, das sich schon mit 90% Alkohol, mit Xylol usw. und mit Kanadabalsam mischt. Es löst Celloidin, aber nicht Paraffin; mit Glyzerin mischt es sich nicht. ^D = 1,57. 310. Bei einer Reihe von Färbungen färbt sich das Celloidin so stark mit, daß es entfernt werden muß. In diesen Fällen klebt man die Celloidinschnitte nach einer der in § 288 bis § 291 angegebenen Methoden auf und kann nun ohne Nachteil das Celloidin durch Einstellen der Ob- jektträger in Äther-Alkohol (aä) entfernen; langsamer erfolgt die Lösung in absolutem Alkohol, in Nelkenöl oder in Methylbenzoat ; hierauf wird das Lösungsmittel durch reinen 96% Alkohol entfernt und der Schnitt wie ein aufgeklebter paraffinbefreiter Paraffinschnitt weiter- behandelt. (§296.) 311. Aufgeklebte Paraffin-Celloidinschnitte bringt man zunächst in Toluol, absoluten Alkohol, Äth(;r- Alkohol, 96% Alkohol usw. wie § 296, s. auch § 283. C. Gefrierschnitte. 312. Uuaufgeklebte Gefrierschnitte überträgt man aus dem destillierten Wasser in die Farblösung. Ist die Fafblösung sehr dunkel und undurchsichtig, so färbt man, um die Schnitte wieder zu finden, besser in der Weise, daß man auf die auf einen Objektträger flach ausgebreiteten Schnitte einige Tropfen der Farblösung bringt. Verdunstet dieselbe leicht, so legt man den Objektträger in eine Petri- schale, auf deren Boden ein angefeuchtetes Filtrierpapier liegt und deckt zu. Nach der Färbung bringt man den Objektträger mit dem Schnitt in die Waschflüssigkeit usw. Will man in Balsam einschließen, so kommen die Schnitte in 80- und 96% Alkohol. Zum völligen Entwässern nimmt man, um starke Schrumpfungen zu vermeiden, statt ab- soluten Alkohol Terpineol oder Karbolxylol (s. aber § 307). Sodann reines Xylol o. dgl., Balsam. Beim Über- tragen von einer Flüssigkeit in die andere bringt man die Schnitte mit Hilfe einer Zupfnadel auf einen eingetauchten Objektträger, damit die Schnitte dabei möglichst glatt liegen und sich nicht falten. Denn die Schnitte werden be- sonders in den Alkoholen und im Xylol so hart, daß sich Falten mit Instrumenten meist nur unter schwerer Beschä- digung des Schnittes entfernen lassen. Zu korrigieren ist 84 Die Färbung. §313—315. eine solche Faltung nur dadurch, daß man den Schnitt wieder in Wasser zurückbringt. Die Weiterbehandlung aufgeklebter Gefrierschnitte er- gibt sich aus § 294. 9. Kapitel. Die Färbung. A. Allgemeines. 313. Die Erkenntnis, daß bestimmte Bestandteile der Zellen und der Gewebe gewisse Farben mit größerer Intensität aufnehmen und festhalten wie andere, war für die Histologie von weittragendster Bedeutung. Denn erst dadurch gelang es, die zahlreichen Strukturen, die infolge ihres Lichtbrechungsvermögens in ungefärbtem Zustand nicht oder nur undeutlich sichtbar und unterscheidbar waren, shcarf hervorzuheben und voneinander zu trennen. 314. Das Ziel einer auf wissenschaftlicher Grundlage basierenden Färbetechnik wäre es, die bei den verschie- denen Färbungen stattfindenden Vorgänge klarzustellen, ein Ziel, das leider zurzeit erst für die wenigsten Fälle er- reicht ist. Eine Reihe von Färbungen beruht zweifellos auf chemischen Vorgängen, so z. B. die Berlinerblau- Reaktion zum Nachweis von Eisen in Schnitten, dann die Reduktion von Osmiumsäure durch bestimmte Fette und einige andere, über welche in einem gesonderten Ab- schnitt berichtet werden soll. Nur in solchen Fällen ist man berechtigt, von einer mikrochemischen Färbung zu sprechen, während für die Mehrzahl der Färbungen diese Bezeichnung noch zu vermeiden ist. 315. Die gut ausgebildeten Färbemethoden haben dagegen den Wert von tinktoriellen Reaktionen, die es ge- statten, Schlüsse zu ziehen, die unter Umständen an Sicher- heit hinter den durch mikrochemische Reaktionen ge- stützten nur wenig zurückbleiben, ohne allerdings über die chemische Beschaffenheit der betreffenden Substanzen Sicheres auszusagen. Wenn es z. B. gelingt, mittels be- stimmter Methoden bestimmte Gewebe und Gewebsteile, z. B. einige Kernbestandteile, Zellgranula, elastische Fasern, kollagene Bindegewebsfibrillen, Schleim u. a. so zu färben, daß stets nur diese allein gefärbt werden, so kann man mit großer Wahrscheinlichkeit darauf schließen, daß man es, wenn eine solche Färbung in einem anderen Präparate wieder auftritt, auch wieder mit demselben Gewebsteil, demselben Stoffe zu tun hat, namentlich wenn auch andere §316. Die Färbung. 8ö Eigenschaften des untersuchten Objektes (Verhalten gegen Lösungsmittel, Verdauungsflüssigkeiten, optische Eigen- schaften u. dgl.) übereinstimmen. Dabei ist aber stets im Auge zu behalten, daß sehr oft ganz verschiedene Ge- websteile gleiches Verhalten gegen Farbstoffe zeigen kön- nen, und daß auch die Vorbehandlung des Präparates (Fixierung usw.) eine Änderung der Reaktionen bewirken kann. Es würde daher zu falschen Resultaten führen, wollte man sich gleich färbende Dinge stets für gleich hal- ten. Solche Schlüsse dürfen nur mit besonderer Vorsicht und auf Grund großer Erfahrung gezogen werden. Da- gegen kann man mit geringen Bedenken annehmen, daß Strukturen, die sich bei gleicher Behandlung verschieden färben, auch in Wirklichkeit verschieden sind. Ebenso wie bei der Fixierung hat man auch bei der Färbung mit der Möglichkeit des Auftretens von Kunstprodukten zu rechnen, weshalb auch hier der Vergleich mit ungefärb- ten wie auch mit frischen, unfixierten Präparaten von großer Wichtigkeit ist. 316. Über das Wesen der Färbung herrschen die größ- ten Meinungsverschiedenheiten, sowohl im allgemeinen, als auch speziell auf histologischem Gebiet. Die während der Fäi'bung stattfindenden Prozesse sind schon als Tatsachen schwierig festzuhalten, da die Chemie und Physik der Zelle und ihrer Bestandteile hierfür noch zu wenig ausgebaut sind und zudem die in Frage kommenden Färbungen in der Regel sehr kompliziert sind. Man ist hier also vorläufig auf reine Empirie angewiesen, da die existierenden all- gemeinen Theorien keinen heuristischen Wert haben; daß bei rein theoretischen Forschungen eine stattliche Anzahl praktisch wichtiger Tatsachen und ursächliche Zusammen- hänge zutage gefördert worden sind, ist besonders hervor- zuheben. Heidenhain (03, S. 335) leugnet die Mög- lichkeit der Entstehung einer Theorie der Färbung auf synthetischem Wege, weil die in Betracht kommenden Stoffe zu mannigfaltig sind. Auf alle Fälle gehören der- artige Untersuchungen in die Hände »gewichtiger Fach- leute der Chemie« (Heidenhain 03, c), welche, mit physi- kalischen Kenntnissen ausgerüstet, tüchtige Histologen sind (näheres über das Thema: Fischer (99), Heiden- hain (02, 03a, b, c,) Bethe (05) ferner über die Chemie der Färbung Michaelis (02) und Pappenheim (Ol)). Von großer Bedeutung für die wissenschaftliche Analyse 86 Die Färbung. §317—323. der Färbungen dürfte in Zukunft auch die kolloidchemische Forschung sein (Bechholdt (13), Liesegang). 317. In einer sehr wertvollen Abhandlung über die Rein- heit der Farbstoffe macht P. Mayer (18) darauf aufmerksam, daß die meisten derselben noch fremde Beimengungen ent- halten. Ganz rein sind nur sehr wenige, wie Pikrinsäure, Thionin, Hämatoxylin, Ahzarin. Die Mehrzahl ist mit Salzen oder Dextrin verunreinigt, »verdünnt«. Diese lassen sich, wenn nötig, meist dadurch entfernen, daß man den Farbstoff mit starkem Alkohol auszieht und das Filtrat wieder ein- dampft. Im übrigen scheinen diese Zusätze für die Färbung meist nicht schädMch zu sein. 318. Da von verschiedenen Fabriken unter demselben Namen oft nicht dieselben Farbstoffe in den Handel kommen, so ist zu beachten, daß sich die folgenden Angaben, wenn nicht besonderes bemerkt ist, auf Farbstoffe beziehen, welche von Dr. G. Grübler und Hollborn in Leipzig geliefert wurden. 319. Ein Übelstand ist, daß bei zahlreichen Färbungs- vorschriften nur sehr ungenaue Mengenbezeichnungen ge- geben werden, wie z. B. Angabe von Tropfenzahl statt cmm, oder gesättigte Lösung statt der Gewichtsmenge des gelösten Farbstoffes usw. (vgl. auch P. Mayer 18). 320. Die verschiedenen Arten der Färbung. Läßt man den Schnitt nur so lange in der (gewöhnlich sehr stark verdünnten) Farbe, bis er genügend gefärbt ist, so spricht man von progressiver Färbung; als regressive Färbung bezeichnet man es dagegen, wenn der Schnitt in der Farb- lösung zunächst überfärbt und der Überschuß der Farbe durch Auswaschen (Differenzieren) mit einer geeigneten Flüssigkeit wieder entfernt wird. Die zur Differenzie- rung benutzte Flüssigkeit muß nach Abschluß des Ver- fahrens sorgfältig entfernt, ausgewaschen werden, da sie sonst über den gewünschten Grad hinaus weiterwirkt und die Färbung unter Umständen zerstört. 321. Man unterscheidet ferner zwischen substantiver (direkter) und adjektiver (indirekter) Färbung. Tingieren sich die Objekte aus einer Farblösung unmittelbar, so färben sie sich Substantiv. Wenn sie sich aber erst nach Vorbe- handlung in einem anderen Stoff in der gewünschten Weise färben, dann spricht man von einer adjektiven Färbung. 322. Von der Färbetechnik her hat man diese Vorbehand- lung als Beize, die betreffenden Farben als Beizenfarbstoffe ' bezeichnet, eine Benennung, die, wie P. Mayer (15) darlegt, in der Mikrotechnik nur für bestimmte Fälle richtig ist. 323. Die regressiven Färbungen geben nur in geübten Händen annähernd konstante Resultate. Für den Anfänger sind progressive Methoden mehr zu empfehlen. § 324—329. Die Färbung. 87 Heidenhain (07) schlägt daher vor, auch mit den basi- schen Anilinfarben möghchst progressiv zu färben, d. h. sie sehr stark zu verdünnen und lange einwirken zu lassen. 324. Wird das Objekt noch vor dem Schneiden als ganzes Stück durchgefärbt, so spricht man von Stück- färbung, während die Schnittfärbung nach dem Schneiden an einzelnen Schnitten ausgeführt wird. 325. Die erstere gestattet rascheres Arbeiten, bei der letzteren kann dagegen die Färbung unter dem Mikroskop stets kontrolliert werden; ferner können bei Schnittfärbung an einem Objekt die verschiedensten Färbemethoden ver- sucht werden; dann kann man sich bei ihr vieler Farben be- dienen, welche zur Stückfärbung nicht angewendet werden können, vor allem gehört hierher die Mehrzahl der Mehrfach- färbungen. In gewissen Fällen lassen sich beide Methoden verbinden, so daß man dasselbe Objekt zuerst im Stück und dann im Schnitt färben kann. 326. Einfluß der Fixierung. Eine Reihe von Fär- bungen (insbesondere auch mit Anilinfarben) läßt sich nur dann mit vollem Erfolg ausführen, wenn das Präparat nach einer bestimmten Fixierungsmethode vorbehandelt wurde. So kann man z. B. nach Fixierung in Flemmingscher Flüssigkeit nur schwer mit Hämalaun tingieren, während die Färbung mit Safranin oder EisenhämatoxyUn ausgezeichnet gelingt. Nach Formolfixierung hingegen färbt sich der Schnitt sehr gut mit Hämalaun, schlechter mit Safranin usw. Aber nicht nur die Fixierung, auch die übrige Vorbehandlung ist von Bedeutung. So vermindert z. B. langes Liegen in Alkohol die Färbbarkeit, insbesondere wenn vom Kork her Spuren von Gerbsäure in den Alkohol gelangen können. Eben- so wirkt langes Ghromieren, lang dauerndes Entkalken u. dgl. 327. Ausführung der Färbung. Der äußerliche Vor- gang der Färbung vollzieht sich meist so, daß man die Farblösung auf den Schnitt eine bestimmte Zeitdauer einwirken läßt und ihn dann in eine Flüssigkeit bringt, in welcher der überschüssige Farbstoff wieder in Lösung geht, z. B. in Wasser oder in Alkohol: man wäscht den Schnitt aus. Im Falle einer guten Kernfärbung hält dann z. B. allein das Chromatin der Kerne den Farbstoff fest. 328. Zur Einübung der Färbetechnik beginne man mit Hämalaun und anderen Hämatoxylin-Verbindungen. Dann erst versuche man den historisch ältesten Farbstoff, den Kar- min. Hat man sich so eine gewisse Übung angeeignet, so ver- suche man die verschiedenen Methoden mit Anilinfarbstoffen. 329. Die Farben werden meist in wässeriger oder alkoholischer Lösung benutzt. Im ersteren Falle wer- 88 Karminfärbung. § 330—333. den die Schnitte zunächst in destilliertes Wasser und aus diesem erst in die Farblösung gebracht, da sonst unter Umständen durch Reste des Alkohols Niederschläge ent- stehen können. Sind die Farblösungen dagegen mit hoch- prozentigem Alkohol angesetzt, so kommen die Schnitte aus 90— 99% -Alkohol in die Farbe. 330. Zur Herstellung wässeriger Farblösungen ver- wende man nur reines, neutral reagierendes dest. Wasser. Um Schimmelbildung zu vermeiden, setzt man der Lösung etwas Thymol, Kampher od. dgl. zu. Vor dem Gebrauch ist die Farblösung, die durch Bedecken des Farbglases vor Verdunsten zu schützen ist, zu filtrieren. Eine Reihe von wässerigen Farblösungen hält sich nur eine gewisse Zeit, weshalb man vielfach die haltbareren alkoholischen Stammlösungen herstellt und diese vor Gebrauch ent- sprechend verdünnt. Wieder andere werden erst nach einer gewissen Zeit zum Färben geeignet, sie müssen erst „reifen", ein Prozeß, der meist in Oxydationsvorgängen besteht (z. B. beim Hämatoxylin Oxydation in Hämatein). 331. Über die Nachbehandlung nach der Färbung s. § 470—493. B. Methoden. 1. Karmin. 333. In neuerer Zeit findet man häufig Klagen dar- über, daß die jetzt erhältlichen Karmine nicht mehr das leisten wie in früheren Zeiten. Zum Teil ist dies in der Ver- wendung schlechter, Beimengungen enthaltender Farben begründet. Nicht verunreinigter Karmin muß sich in Ammo- niak restlos lösen. Mit dem von Grübler bezogenen Kar- min und Karminsäure (letztere auch von Kahlbaum) machte ich gute Erfahrungen (vgl. auch P. Mayer 18). Oft beruht eine schlechte, diffuse Karminfärbung auch auf nachfolgender ungenügender Differenzierung. Besonders verlässige Resultate bekommt man mit den beiden folgenden haltbaren Lösungen: 333. Karmalaun nach P. Mayer (92). In 200 ccm Aqua dest. löst man unter Erwärmen 10 g Kalialaun und hierauf 1 g Karminsäure. Nach dem Erkalten filtriert man und setzt Thymol oder 1 ccm Formol zu. Schnitt- färbung: 10 — 15 Min.; dann einige Sekunden bis Minuten in 1%-Alaunlösung und gründhches Auswaschen mit Wasser. Stückfärbung; 24 — 48 Stunden. Ebensolanges Auswaschen in Wasser, Resultat: kräftige, fast reine Kernfärbung. § 334—337. Karminfärbung. 89 334. Parakarmin nach P. Mayer (92) färbt noch kräftiger. Man löst unter vorsichtigem Erwärmen 1 g Karminsäure, 0,5 g Chloraluminium und 4 g Chlorkalzium in 100 ccm eines 70% Alkohols, läßt erkalten, absetzen und filtriert. Zur Färbung verdünnt man nach Krause (11) mit dem 5— lOfachen Volumen 70% Alkohol und setzt auf 100 ccm etwa 2 Tropfen Essigsäure zu. Schnittfärbung in ca. 10 Min. Auswaschen in 70%- Alkohol. Stückfärbung in 24 — 48 Stunden. Dann ebensolanges Auswaschen mit 70%-Alkohol, der evtl. etwas angesäuert ist. 335. Die mit Karmalaun und Parakarmin zu färbenden Objekte dürfen nach P. Mayer nicht alkalisch reagieren oder viel Kalk enthalten, da sonst Farbniederschläge entstehen. Feine Skeletteile, Kalknadeln u. dgl. werden gelöst. Bei Überfärbung und für reine Kernfärbung wasche man in 2 %- Essigsäure (in 70%-Alkohol) aus, dann Entfernung der Säure durch 70%-Alkohol oder Wasser. Da die Parakarminlösung alkoholisch ist, brauchen die mit ihr zu färbenden Präparate nicht mit Wasser in Berührung zu kommen, was unter Um- ständen von Wert ist. Weitere Karminlösungen sind: 336. Alaunkarmin (Grenacher): Man löst 3 — 5g KaH- oder Ammoniakalaun in 100 ccm Aqua dest., setzt 1 g Kar- min zu und kocht anhaltend 15 Minuten lang; nach dem Er- kalten wird filtriert. Zusatz von 1 ccm Formol. Färbung: Schnitte kommen aus Aqua dest. auf ^4 his 24 Stunden in die Farbe und werden dann in dest. Wasser so lange gewaschen, bis keine Farbwolke mehr abgeht. Für Stückfärbung weniger geeignet. Resultat: fast ausschUeßlich Kernfärbung. 337. Für Stückfärbung ist besonders die alkoholische Boraxkarminlösung zu empfehlen. 4 g Borax werden mit 2 — 3 g Karmin in der Reibschale verrieben, in 93 ccm dest. Wassers gelöst und mit 100 ccm 70%-Alkohols versetzt. Nach öfterem Schütteln wird nach Ablauf von 24 Stunden dekantiert und filtriert. 0,5 — 1 ccm große Stücke werden nach Fixierung und Auswaschen aus 70% - Alkohol auf 24 Stunden in die Farblösung übertragen, größere ent- sprechend länger. Hierauf kommen sie sofort (ohne mit Wasser in Berührung zu kommen) in salzsäurehaltigen 70%-Alkohol (0,5 — 1% Salzsäure), worin sie so lange blei- ben, bis keine Farbwolken mehr abgehen (24 Stunden und länger). Sodann gründUches Auswaschen in 70%-Al- kohol, dann 80% -Alkohol usw. Subhmat fixiertes Material ist für diese Färbung, welche exakte Chromatinfärbung liefert, besonders geeignet, 90 Hämatoxylinfärbung. §338—342. 338. Zur Herstellung der wässerigen Boraxkarmiiilösuiig verreibt man 2 — 3 g Karmin mit 8 g Borax und setzt 130 ccm dest. Wasser zu. Nach 24 Stunden wird filtriert. Färbung wie oben. Die wässerige Lösung ist weniger zu empfehlen, da sie leicht mazeriert. 339. Lithionkarmin (Orth): 2,5 — 5 g Karmin wer- den unter Aufkochen in kaltgesättigter wässeriger Lösung von Lithionkarbonat gelöst. Nach Erkalten wird filtriert. Schnittfärbung: 2 — 5 Minuten. Sodann Differenzieren in Salzsäurealkohol, 15 Minuten bis 24 Stunden. Auswaschen in Wasser usw. Die Lösung färbt intensiv und rasch und gibt auch bei Präparaten, die sich infolge ihrer Fixierung mit den anderen Karminen weniger gut färben, schöne Resultate. Für Stück- färbung zarter Objekte ist sie jedoch weniger zu empfehlen, da sie infolge des starken Alkaligehaltes leicht mazerierend wirkt. 340. rochenilletinktur nach P. Mayer (81): 10 g pulveri- sierte Cochenille extrahiert man mehrere Tage lang mit 100 ccm 70% -Alkohol ohne Erwärmen, schüttelt die Tinktur öfter um und filtriert endlich ab. Die Objekte kommen aus 70%- Alkohol je nach der Größe auf Stunden bis Tage in die Farbe und werden dann mit 70%-Alkohol sorgfältig ausgewaschen. Die Färbung ist meist weniger scharf als bei den guten Kar- minlösungen, insbesondere, wenn die Objekte von der Fixie- rung her noch sauer reagieren. S. ferner § 1444. Weitere, meist entbehrliche Cochenilletinkturen s. Rabl (94), Spuler (Ol). 2. H ämato xylin. 341. Das Hämatoxylin bildet mit seiner Einführung in die Mikrotechnik durch Waldeyer den Ausgangspunkt der wertvollsten Färbemethoden. Der Farbstoff wird durch Ätherextraktion aus Blauholz gewonnen; er bildet farb- lose, in Wasser, Glyzerin und Alkohol lösliche Kristalle. 342. Die mit Hämatoxylin hergestellten Farblösungen erlangen ihr Färbungsvermögen vielfach erst nach einiger Zeit, sie müssen „reifen". Damit bezeichnet man die Um- wandlung des Hämatoxylins in Hämatein, zu dem das Hämatoxylin durch Wasserstoffabgabe oxydiert wird. Das Hämatein ist also, meist in Verbindung mit Tonerde, die eigentliche bei der Färbung wirksame Substanz (P. Mayer (15) und früher). Durch Zusatz kräftiger Oxyda- tionsmittel, v^e z. B. von Wasserstoffsuperoxyd oder über- mangansaurem Kali kann man den Oxydationsprozeß, der, sich selbst überlassen, mehrere Wochen beansprucht, § 343—346. Hämatoxylinfärbung. 91 sehr beschleunigen. Im übrigen ist das Hämatein auch schon direkt als Hämatein. cristallisat. im Handel er- hälthch. 343. Von den zahlreichen mit Hämatein hergestell- ten Farblösungen sollen nachfolgend nur die wichtigsten und allgemein gebräuchlichsten angeführt werden (Litera- tur über Hämatein insbesondere: P. Mayer und Rost). Besonders empfohlen sei das Hämalaun von P. Mayer und die saure Hämatoxyhnlösung von Ehrlich. 344. Vortrefflich und auch für den Anfänger sehr zu empfehlen ist das von P. Mayer (91, 92) angegebene Hämalaun, das sofort nach dem Bereiten benutzt werden kann und (namentlich verdünnt) nicht leicht überfärbt. Herstellung: lg Hämatein wird in 50 ccm Alkohol von 90% unter Erwäi^men gelöst und zu einer Lösung von 50 g Alaun in 1 1 dest. Wassers gegossen. Thymolzusatz. Nach Erkalten filtrieren. (Die Farbe ist bei Grübler auch schon zusammengesetzt in Substanz käuflich, so daß man nur in Wasser 1:20 zu lösen braucht.) Schnittfärbung: Die Schnitte kommen aus dest. Wasser auf etwa 3 — 5 Min. in die Farne, bis die Kerne gut gefärbt sind (kontrollieren!). Sodann ward mindestens 10 Min. in mehrfach gewechseltem oder in fließendem Brunnen- wasser ausgewaschen, da erst dadurch der tiefblaue Ton der Färbung in voller Stärke hervortritt. Resultat: Kernchromatin tiefblau, Knorpel blau, das übrige Gewebe ungefärbt oder etwas graublau. Auch Stückfärbung ist mit Hämalaun möglich. Dauer 24—48 Stunden, dann ebensolange Auswaschen mit dest. Wasser. Die Farblösung ist etwa ein Jahr lang brauchbar. Doch geben Lösungen, die älter als 34 Jahr sind, keine so reinen Kernfärbungen mehr ^vie frische. Auch nimmt die Färbekraft so sehr zu, daß leicht Überfärbung eintritt. 345. Man färbt mit Hämalaun am besten progressiv (vgl. §320), da sich eine Überfärbung mit Hämalaun ebenso wie bei den anderen Hämatoxylin-Lösungen durch einfaches Auswaschen nicht verbessern läßt. Man kon- trolliert also zeitweise den Stand der Färbung, indem man den Schnitt aus der Farbe nimmt, in Wasser abspült, unter dem Mikroskop betrachtet und, falls die gewünschte In- tensität der Färbung erreicht ist, dieselbe unterbricht. Andernfalls kommt der Schnitt wieder in die Farbe zurück. 346. Eine Überfärbung läßt sich dadurch korrigieren, daß man das Präparat in eine schwache Säure bringt (z. B. in 0,1%-Salzsäure). Der Schnitt wird dann röthch und ver- 92 Hämatoxylinfärbung. § 347—353. liert Farbe. Wenn der richtige Färbungsgrad erreicht ist, muß äußerst sorgfältig mit Brunnenwasser ausgewaschen werden, da selbst geringste zurückbleibende Säurespuren die Färbung allmählich zerstören. Zweckmäßig bringt man dann die Schnitte noch in 70%-Alkohol, dem etwas Natrium- bikarbonat oder Ammoniak (etw^a 0,1%) zugesetzt ist. Am besten ist es aber, eine Überfärbung einfach zu vermeiden. 347. Will man eine ganz reine Kernfärbüng, dann bringt man den Schnitt nach der Färbung kurze Zeit in 0,5 — 5%- Alaunlösung und wäscht dann sorgfältig in fheßendem Wasser aus. Auch zur Korrektion von Uberfärbung kann man die Alaunlösung benutzen. 348. Nelkenöl und Bergamottöl schädigen die Halt- barkeit der Färbung und sind daher zu vermeiden. 349. Neuerdings löst P. Mayer (04) zur Herstellung von Hämalaun 1 g Hämatoxylin in 1 1 Wasser und gibt 50 g Alaun und zur Oxydation 0,2 g Natriumjodat (NaJOg) zu. Mehrmals schütteln. Nach völliger Lösung wird filtriert. 350. Hämateinlösung I A nach Apathy (97a) besteht aus gleichen Teilen von a) Glyzerin, b) 9 g Alaun, 3 com Eisessig und 0,1 g Salizylsäure auf 100 com dest. Wasser und c) 1%-Hämatoxylinlösung in 70%-Alkohol, welche 6—8 Wochen lang gestanden (gereift) hat. Statt c) nimmt P. Mayer (Ol) eine 1%- Hämateinlösung. Brauchbar für Schnitt- und Stückfärbung. Nach dem Färben wird sorg- fältigst mit Wasser ausgewaschen. Die Lösung färbt außer Chromatin häufig auch noch andere Gewebsstrukturen. Das Gemisch ist jahrelang haltbar. 351. Delafieldsches Hämatoxylin (s. Prudden 85). Man löst 4 g Hämatoxyhn in 25 ccm absoluten Alkohols und setzt diese Lösung zu 40 ccm einer gesättigten wässe- rigen Lösung von Ammoniakalaun (d. h. etwa 40 g Ammo- niakalaun auf 400 ccm Wasser). Nach 3 — 4 Tagen, während deren man die Flüssigkeit offen und dem Licht ausgesetzt stehen läßt, filtriert man und gießt je 100 ccm Glyzerin und Methylalkohol zu. Nach einigen Tagen wird aber- mals filtriert. Zur Färbung verdünnt man ziemlich stark mit Wasser. Sodann Auswaschen mit Wasser. Die Farb- lösung ist nicht sehr lange haltbar. ^ 352. Friedländersches Hämatoxylin. Eine Lösung von 2 g Hämatoxylin in 100 ccm absoluten Alkohols kommt zu 100 ccm dest. Wasser, 100 ccm Glyzerin und 2 g Kali- alaun. 353. Ehrlich (86) setzt zu dieser Lösung noch 10 ccm Eisessig. Dadurch wird eine Überfärbung vermieden. Schnitt- und Stückfärbung wie in §344. Die Schnitte § 354—358. Hämatoxylinfärbung. 93 sehen, aus der Farbe genommen, rotviolett aus und bläuen sich erst beim Auswaschen, was beim Kontrolheren der Färbung zu beachten ist. Diese jahrelang haltbare Farb- lösung liefert sehr schöne Kernfärbungen. Sowohl das Friedländersche wie das Ehrlichsche Hämatoxyhn muß vor Gebrauch mindestens 14 Tage lang in unbedecktem Gefäß reifen. Nimmt man statt Hämatoxyhn 2 oder besser nur 1 g Hämatein, so sind die Lösungen sofort gebrauchsfertig. 354. Hämatoxyhnalaun nach Böhmer. Die Mengenbezeich- nung in der Originalvorschrift ist sehr ungenau. Am besten löst man 1 g Hämatoxyhn in 10 ccm 96 %-Alkohol und schüttet diese nach Lösung in eine 10% ige filtrierte Kalialaunlösung. Reifen der Lösung wie in § 353 nötig. 356. Hansen (95) beschleunigt die Oxydation des Häma- toxyhns durch Zusatz von Kaliumpermanganat, a) 1 g Häma- toxyhn wird in 10 ccm absoluten Alkohols gelöst; b) 20 g Kalialaun in 200 ccm warmen dest. Wasser; nach Abkühlen wird filtriert; am folgenden Tag mischt man a) und b) in einer Porzellanschale, gießt 3 ccm einer kaltgesättigten wässerigen Kahumpermanganatlösung dazu und erwärmt unter stetem Umrühren bis zum Sieden. Nach ^ bis 1 Min. kühlt man rasch ab und filtriert. 356. Unna nimmt zur Beschleunigung der Oxydation Wasserstoffsuperoxyd. 357. Während die genannten Hämatoxylinlösungen bei richtiger Anwendung hauptsächlich reine Chromatin- färbungen geben, lassen sich mit den nachfolgenden Häma- toxylinlösungen auch noch zahlreiche andere Gewebs- bestandteile färben. Die wichtigste von ihnen ist die M. Heidenhai nsche Eisen hämatoxylinmethode. 358. Eisenalaun-Hämatoxylin nach M. Heidenhain (92, 94, 96, 17). 1. Vorbehandlung. Mit Wasser auf- geklebte Schnitte (höchstens b /n) kommen auf 2 — 12 Stun- den in. eine 1,5 bis 5% ige wässerige Eisenalaunlösung (für Zentralkörper: Vorbehandlung in einer 2,5% - Lö- sung für 6 — 12 Stunden). 2. Färbung. Nach kurzem Abspülen in dest. Wasser wird 1 — 36 Stunden in einer gereiften 0,5% -Hämatoxyhnlösung gefärbt (Zentralkörper 24 — -36 Stunden). Herstellung der Farblösung: Man löst lg Hämatoxyhn in 10 ccm 96% -Alkohol, setzt 90 ccm dest. Wasser zu und läßt mindestens 4 Wochen lang reifen. Zum Gebrauch wird mit dem gleichen Volumen dest. Wassers verdünnt.) 3. Differenzierung. Man bringt die Schnitte in die zur Vorbehandlung benutzte Eisenalaun- lösung, in der die pechschwarz gefärbten Schnitte sehr bald viel Farbe abgeben. Von Zeit zu Zeit kontrolliert man den 94 Hämatoxylinfärbung. § 359 — 363. '>^ Grad der Entfärbung (evtl. mit Wasserimmersion), wobei man sie vorher immer in reichlichem Brunnenwasser ab- spült, um die Differenzierung zu unterbrechen. Je weiter die Entfärbung fortschreitet, desto häufiger muß man kon- trollieren; unter Umständen differenziert man gegen Ende mit einer stark verdünnten Eisenalaunlösung (z. B. 0,5%), um den Vorgang zu verlangsamen. Ist der richtige Grad erreicht, dann wäscht man 15 — 60 Min. in fließendem oder oft gewechseltem Wasser sehr gut aus. Resultate: Chro- matinstrukturen, Nukleolen, Zellgranula, Mitochondrien, Zentrosomen, bestimmte Teile der quergestreiften Musku- latur u. a. sind je nach dem Grade der Differenzierung mehr oder weniger stark schwarz gefäi^bt. Die außerordent- lich klar und schön gefärbten Strukturen müssen aber zur Vermeidung von Trugschlüssen sehr sorgfältig beurteilt werden, da sich mit dieser Methode eben die verschiedensten Substanzen färben lassen. 359. Die Eisenalaunlösung muß aus schönen hellvioletten Kristallen hergestellt werden, wobei nicht erwäi-nit werden darf. (Synonyme: Eisen-Ammon-Alaun, schwefelsaures Eisen- oxydammoniak, Ferriammoniumsulfat). 360. Man kann die Schnitte zur Plasmafärbung auch mit Bordeaux R in wässeriger dünner Lösung vorfärben oder in einer ebensolchen von Rubin S (Säiirefuchsin), Orange G oder Li cht grün ca. 5 Min. nachfärben. Auswaschen in 50%- Alkohol, dann 70*^/0 usw. Man vermeide ätherische Öle (Ber- gamottöl usw.). 361. Material, das in osmiumsäurehaltigen Flüssigkeiten fixiert wurde, bringt man, bis die Osmiumschwärzung ver- schwunden ist, vor der Eisenalaunbehandlung nach Straß- burger (05) auf etwa 1 Stunde in die käufliche Wasserstoff- superoxydlösung, oder man bleicht nach Pal (s. §548). Ich ziehe das letztere als schonender vor (vgl. auch § 631 ff). 362. Eisenhämatoxylin von Weigert zur Kernfäibung. Lösung a: 1 g Hämatoxylin in 100 ccm 96% -Alkohol. Lösung b : 4 ccm Liquorferri sesquichlorati , 1 ccm offizi- neile Salzsäure, 95 ccm dest. Wasser. Unmittelbar vor Gebrauch mischt man gleiche Teile von a und b. Die ge- trennten Lösungen sind lange haltbar, während die Mi- schung bald verdirbt. Färbung: Die möghchst dünnen Schnitte kommen aus Wasser für 1 — 5 Minuten in die Farb- lösung. Sodann Auswaschen in Brunnenwasser. Ein Diffe- renzieren ist nicht nötig. 363. Zur NacMärbung kann man die Schnitte in eine Mischung von 100 ccm einer konzentrierten wässerigen Pikrinsäurelösung und 5 — 10 ccm einer l%igen wässe- §364—368. Hämatoxylinfärbung. 95 rigen Säurefuchsinlösung bringen, nach etwa 1 Min. kurz abspülen mit Wasser oder besser nur abtrocknen mit glattem Filtrierpapier, 96% -Alkohol usw. (vgl. auch § 415 f.). 364. Der Liqu. ferr. sesquichlor. ist eine 10% wässerige Lösung von Eisenchlorid. Die offizinelle Salzsäure hat ein spezifisches Gewicht = 1,124 und enthält 25% HCl. 365. Chromalaundioxyhämatein von Hansen (05). Her- stellung: 10 g Chromalaun, chemisch rein, werden in 250 ccm dest. Wassers gelöst. Die Lösung wird gekocht, bis sie ganz grün ist. Sodann wird darin unter Umrühren 1 g Hämatoxylin gelöst. Nach dem Erkalten fügt man 5 ccm einer 10 %-Schwefel- säure zu. Dazu kommt tropfenweise unter stetem Umrühren eine erkaltete Lösung von 0,55 g Kaliumbichromat in 20 ccm dest. Wassers. Sodann erwärmt man die Mischung bis zum Kochen und läßt so lange sieden, bis die Lackbildung vollendet ist (meist schon nach 1 — 2 Minuten). Vor dem Gebrauch wird filtriert. Färbedauer etwa 5 Minuten; gibt Chromatin- und Plasmafärbung; bei vermehrtem Säurezusatz (6 — 7 ccm) erzielt man reine Ghromatinfärbung. Die Farblösung ist einige Monate haltbar. 866. Mallorysches Hämatoxylin (Ol): 0,1 g Hämatoxylin wird in 80 ccm dest. Wassers unter Erwärmen gelöst; dazu kommen nach Abkühlen 20 ccm einer 10% igen Lösung von Phosphorwolframsäure (Merck) und 0,2 ccm Wasserstoff- superoxyd zur Beschleunigung der Oxydation. Nach 12 bis 24stünd. Färben rasch waschen in Wasser, dann 95 %- Alkohol, ,Origanumöl, Xylol, Kanadabalsam. Resultat: Kerne, Neu- rogliafasern u. a. blau, Nervenfasern rosa, Bindegewebe tief rosa. M. fixiert dazu 4 Tage in Formol 1:4 dann ebenso- lange in gesätt. Wässer. Lösung von Pikrinsäure und hierauf bei 37° in einer 5% Wässer. Lösung von Ammoniumbichromat. Dann ohne Wässern durch Alkohol in Celloidin. Nach anderen Fixierungsmethoden färbt sich das Bindegewebe meist blau. Das ältere Mallorysche Hämatoxyhn (91) verdankte seine Färbekraft einer unbekannten Verunreinigung der Phosphor- molybdänsäure (s. a. § 1020). 367. v. Szüts (14) gibt zu 100 ccm einer 10%igen wässerigen Hämatoxyhnlösung 25 ccm einer 10%-Ammoniummolybdat- lösung (sofort gebrauchsfertig). Man färbt 1—2 Min., spült in dest. Wasser ab und bläut ca. 10 Min. in Leitungswasser. Resultat wie 366. Fixierung behebig; nur nicht in Osmium- säure (s. a. § 1022). 868. Vanadium-Hämatoxyliu nach M. Heidenhain (03 und 08b). Bei der Herstellung desselben verfahre man genau nach folgender Vorschrift: zu 200 ccm einer frischbereiteten 0,5% -Hämatoxyhnlösung gießt man 100 ccm einer 0,25%- Lösung von Ammonium vanadinicum. Diese 300 ccm setzt man in einer offenen Kochflasche von 500 ccm Inhalt der Oxydation aus, wobei man nach je 24 Stunden umschüttelt. 96 Hämatoxylinfärbung. § 369—371. (Bei Zimmertemperatur; cave Erhitzen!). Nach einigen Tagen mache man eine Probefärbung, die man dann alle 24 Stunden wiederholt, bis die Lösung das Bindegewebe prachtvoll blau, die Muskulatur goldbraun färbt. Dann füllt man die Farb- lösung in einen Scheidetrichter von 500 ccm und überschichtet mit Paraffinöl, um ein weiteres Fortschreiten der Oxydation zu verhüten. Auf diese Weise kann die Färbekraft der Lösung einige Monate erhalten werden. Zur Färbung eignen sich nur sublimatfixierte Objekte (besonders in Subtrie § 192). Man bringt dünne Schnitte (5 fi) etwa 5 — 10 Minuten in die Farbe, wäscht gut in Wasser aus, entwässert und bringt sie schnell durch Xylol in Balsam. Resultat: Starke Protoplasma- färbung in gewöhnlich sepiabraunem Tone (besonders schön: Schleimspeicheldrüsen), starke Färbung des Oxychromatins, schwache des Basichromatins, Gelbfärbung der Nukleolen, oft Blaufärbung des Mucins und des Bindegewebes, Orange- färbung der roten Blutkörperchen, Muskulatur meist goldbraun (Sarkolem und Z-Streifen am Herzen bläuhch). Die Färbung hält sich jahrelang unverändert, ist aber nur Geübten zu empfehlen. 369. Die R. Heidenhainsche Hämatoxylinfärbung ist eine Stückfärbung. Man bereitet eine y^%\gQ wässerige Lösung von Hämatoxylin. Dieselbe kann frisch verwendet, im Lichte aber nicht lange aufbewahrt werden. Färbung: Die in Alkohol oder gesättigter Pikrinsäurelösung fixierten Objekte kommen für 24 Stunden in die Farbe, dann ebensolange in eine 0,5% ige wässerige Lösung von einfach chromsaurem Kalium (Kalium chromicum flavum). Dieses wird durch die auftretenden Farb- wolken rasch gefärbt und muß daher mehrmals gewechselt werden. Dann Auswaschen in Wasser und Weiterbehandlung in steigendem Alkohol usw., Einbetten in Celloidin oder Paraffin. Die Schnitte dürfen höchstens 5 ^i dick sein. Neben der Kern- färbung erhält man ausgezeichnete Protoplasmafärbung. 870. Wenn man eine 0,5% ige Hämatoxyhnlösung und eine 0,5 bis l%ige Chromkahumlösung in großen Mengen nur wenige Stunden einwirken läßt, und die letztere öfters wechselt, so erhält man nach Apathy eine aschgraue Färbung, die auch an dickeren Schnitten noch deutliche Bilder ge- währt. 371. Für Stückfärbung empfiehlt 0. Schultze (10) eine Osmium-Hämatoxylinmelhode. Sehr kleine Organ- stückchen werden nach § 149 in 1 — 2% iger Osmiumsäure fixiert; nach 24 — 48 Stunden wird die Osmiumsäure ab- gegossen und durch destilliertes Wasser ersetzt. Nach einigen Minuten (spätestens in 24 Stunden) kommen die Objekte in eine 0,5% ige alkoholische (70%) gereifte Häma- toxylinlösung, die man vorher zur Reifung 2 — 3 Tage lang in offener Flasche bei 35 — ^40^ G stehen läßt. Die Farblösung schwärzt sich zunächst und wird 1 — 2 mal § 372—376. Anilmi'arben. 97 gewechselt, bis sie ihre braune Farbe behält. Nach 2tägi- gem Stehen bei Zimmertemperatur wird in 70% igen Al- kohol übertragen und dieser so oft erneuert, bis er sich nur noch wenig bräunt. Nach 24 Stunden Übertragen in 96% igen Alkohol, absoluten Alkohol, Zedernöl, Paraffin (1 Stunde oder kürzer). Die Schnitte sollen nicht über 2 f.1 dick sein. Resultat: Darstellung der Zellgrenzen, der Interzellularsubstanzen und Kittleisten, Epithelfasern, Granula, Ghondriosomen, Struktur der quergestreiften Muskulatur usw. 372. Bei einer älteren Methode (04) fixiert O. Schnitze in Chromsäure oder Chromsalze enthaltenden Flüssigkeiten wie in einer Mischung von 3%igem Kaliumbichromat und 2% Osmiumsäurelösung (3:1) oder in Flemming u.dgl. Die fixierten Stücke kommen ohne Wässern gleich in 50- und 70% igen Alkohol und sodann in die Hämatoxylinlösung wie in §371. Bergamottöl löst die Ghromsalzhämateinverbindung. 3. Anilinfarben, a) Allgemeines. 373. Auch bei der Färbung mit Anilin- oder Teer- farben unterscheidet man zwischen progressiver und re- gressiver Färbungsmethode (vgl. auch §320). Bei An- wendung der ersteren arbeitet man in der Regel mit stark verdünnten Lösungen, während man für regressive Färbung meist konzentriertere Lösungen benutzt. 374. Gute, zum Teil progressive, zum Teil regressive Kernfärbungen erhält man mit Safranin, Thionin, Toluidinblau, Gentianaviolett, Methylgrün. Zur Färbung anderer Zellbestandteile werden hauptsächlich Orange G, Eosin, Fuchsin S, Bleu de Lyon, Licht- grün usw. verwendet, wobei man sie aber seltener allein, ,als vielmehr im Anschluß an eine Kernfärbung anwendet. Dabei ist man meist bestrebt, möglichst differente Farben zu kombinieren, wie rot und blau oder rot und grün u. dgl. 375. Die Zahl der in der Mikrotechnik verwendbaren Anilinfarbstoffe ist an und für sich sehr groß, für gewöhnlich kommt man aber mit einer ziemhch geringen Zahl aus, da die Mehrzahl der Farben, abgesehen von geringen Farbnuancen, sich in ihren für mikrotechnische Zwecke ausnutzbaren Eigen- schaften meist ziemhch ähnhch ist. Im nachfolgenden sollen daher auch nur die wichtigsten angeführt werden. 376. Zur Verstärkung der Färbung wird der Farb- stoff oft in Anilinwasser gelöst. Unna (10a) empfiehlt Romeis, Taschenb. d. mikrosk. Technik. 8. Aufl. 7 98 Anilinfarben. § 377—380. aus dem gleichen Grunde Zusatz von Thymen zur wässeri- gen Lösung. 377. Ein großer Nachteil der oft ungemein konstrast- reichen Anilinfärbungen ist ihre häufig nur sehr geringe Haltbarkeit. Es ist sehr äi^gerlich, wenn man die Fäi^bungen schon nach einem halben Jahre oder noch eher, oft vor Beendigung der Untersuchungen, ausgeblaßt findet. In jenen Fällen, in denen es auf lange Haltbarkeit der Prä- parate ankommt, wähle man daher eine Methode, bei der wenigstens die Kernfärbung dauerhaft ist. Meist sind dies Kombinationen von einer Kai^minkernfärbung od. Hämatein kernfäi^bung (auch Eisenhämatoxylin) und einer Anilin- plasmafärbung. 378. Sehr oft wird die Anilinfäi'bung schon beim Entwässern der Präparate mit Alkohol stark angegriffen. Auch Karbolxylol ist für viele Anilinfärbungen schädlich. Man hilft sich oft dadurch, daß man die (aufgeklebten) Präparate mit Fließpapier abtrocknet, um die größte Menge des Wassers zu entfernen, sie dann nur kurz in absoluten Alkohol eintaucht und mit 2 — ^3 mal gewechseltem Xylol weiterbehandelt. Die Entfernung auch der gering- sten Alkoholspuren ist sehr wichtig, da diese das Ausblassen wesentlich beschleunigen. In anderen Fällen vermeidet man den Alkohol ganz und ent- wässert in Azeton. Man bringt die Präparate dazu zuerst kurz in reines Azeton, dann in Azeton-Xylol 3:1, 1:1, 1:3 und endlich in reines Xylol. Die Mischungen mit Xylol wendet man an, um den Aufenthalt in reinem Azeton nicht zu sehr auszudehnen, da auch dieses häufig die Farbe auszieht. Sehr wertvoll ist für viele Anihnfäi'bungen auch die Entwässerung in Bergamottöl, das man schließlich ebenfalls durch Xylol ersetzt. 379. Mit großem Vorteil kann man Terpineol zum Entwässern der Präparate verwenden, das sich schon mit 85 — 90% - Alkohol mischt und auch empfindliche Färbungen nicht angreift. P. Mayer empfiehlt es auch als Einschlußmedium für derartige Präparate (vgl. § 491). 380. Von Einfluß auf die Haltbarkeit wie auch überhaupt auf den Ausfall der Färbung ist auch die Fixierung des Objektes, worauf sehr oft nicht geachtet wird. Sind z. B. von dieser her noch Säure- spuren im Gewebe zurückgeblieben, so werden diese auf säureempfindliche Farben schädlich wirken. Ferner sei nochmals auf die Schädlichkeit von Jodspuren hingewiesen § 381—386. Anilinfarben. 99 (vgl. § 176). Alle mit Jod in Berührung gekommenen Prä- parate müssen unbedingt mit Fixiernatron ent jodet wor- den sein. Eine Reihe von Anilinfäi^bungen ist ferner nur nach bestimmten Fixierungen möglich. 381. Als Einschhißmedium nimmt man für gewöhn- lich ganz reinen, neutralen Kanadabalsam, den man in Xylol löst. In saurem Kanadabalsam geht die Färbung meist sehr bald zugrunde. Heidenhain empfiehlt ferner zur Verhütung des Ausbleichens, die Balsamschicht mög- lichst dünn zu machen; er beschwert deshalb das Deck- glas nach dem Eindecken mit einem Bleigeschoß (evtl. im Thermostaten bei 45^ C). Wichtig ist ferner, daß das Präparat von einem breiten Rand umgeben ist. Man nehme daher nicht zu kleine Deckgläser. 382. Fixierung der Färbung. Ein anderer Weg, um die Fäi'bungen dauerhaft zu machen, ist der, die Farbe im Schnitt zu fixieren, d. h. mehr oder weniger unlöslich zu machen. Methylenblau gefärbte Schnitte bringt man z. B. auf mehrere Stunden in eine 5% wässerige Lösung von molybdänsaurem Ammonium, wäscht dann einige Minuten aus und bringt sie durch Alkohol (ca. 1 Min.) in Xylol. Derart fixierte, zum Teil mit Chromotrop nach- gefärbte Methylenblaupräparate haben sich mir nun schon 10 Jahre unverändert gehalten. Statt Ammoniummolybdat kann man auch eine gesättigte Lösung von Ammonium- pikrat verwenden. (Vorsicht, trocken leicht explosibel.) (Vgl. auch § 1044.) 383. Schuberg bringt die mit basischen Anilin- farben, wie Dahlia, Fuchsin, Methylgrün u. a. gefäi^bten Schnitte nach Auswaschen in dest. Wasser auf 3 — 5 Min. in eine 10% wässerige Tanninlösung, wäscht wieder in Wasser aus, überträgt dann 3 — 5 Min. in eine 2 — 3% wässerige Lösung von Brechweinstein und wäscht aber- mals in Wasser aus. 384. Nach Unna (10a) kann die Haltbarkeit der Färbungen oft durch Zusatz von Thymen zum Xylol und zum Kanada- balsam gebessert werden. 385. Vgl. auch die Fixierung von Anilinfärbungen durch Sublimat (§466, Formol §439, ferner §400). 386. Über die Einteilung der Anilinfarbstoffe. Ehr- lich klassifiziert die Anilinfarbstoffe, von anderen Gesichts- punkten wie der Chemiker ausgehend, in saure, basische und neutrale. (Nach Giemsa (11) besser als azido- chrom, basochrom und amphochrom bezeichnet.) Saure 7* 100 Anilinfarben. §387—388. (azidochroine) Farbstoffe nennt Ehrlich jene Verbin- dungen, bei denen, wie im pikrinsauren Ammonium, eine Säure das färbende Prinzip darstellt. Zu ihnen gehören z. B. Aurantia, Benzoazurin, Bordeaux, Eosin, Erythrosin, Indulin, Kongoroth, Lichtgrün S. F., Nigrosin, Orange, Säurefuchsin u. a. Sie färben hauptsächlich das Proto- plasma der Zellen und viele ihrer Produkte. Sie sind schwer löslich in Alkohol und leichter löslich in Wasser. Die basischen (basochromen) Farbstoffe sind, wie das essigsaure Rosanilin, aus einer Farbbase und einer indiffe- renten Säure entstanden gedacht. Dazu gehören: Bismarck- braun, Fuchsin, Gentianaviolett, Methylenblau, Methyl- grün, Methylviolett, Thionin, Toluidinblau u. a. Sie sind chromatinfärbend, färben aber auch gewisse Granula, Schleime usw. Sie sind leicht in Alkohol und schwer in Wasser löslich. Die neutralen (amphochronien) Farbstoffe schließ- lich denke man sich als Salze, welche, wie das pikrinsaure Rosanilin, durch Zusammentritt einer Farbbase und einer Farbsäure entstehen. 387. Die meiste färbbare Eiweißsubstanz ist nach Pappen heim amphophil, d. h. sie läßt sich bei Anwendung homogener basischer oder saurer Fai'bgemische sowohl mit der einen wie mit der anderen Komponente färben. Davon gibt es eigentlich nur zwei Ausnahmen, nämlich die reifen eosinophilen Leukozytengranula, die sich nur mit sauren (azidochromen), und die basophilen Mastzellen- granula, die sich nur mit basischen (basochromen) Farb- stoffen färben. Die Bezeichnung der anderen, demnach eigentlich amphophilen Substrate als azido- bzw. basophil bedeutet also nur, daß im amphoteren Molekül entweder die saiu-en Kai'boxyl- oder die basischen Amidogruppen an Zahl oder chemischer Affinität überwiegen, so daß bei Anwendung eines heterogenen, neutralen Gemisches saurer und basischer Farbstoffe die einen Substrate nur den basischen, die andern nur den sauren Farbstoff auf- nehmen, die andere Farbgemischkomponente aber zurück- weisen. Im Falle der Neutrophilie halten sie sich wohl die Wagschale. Basophilie und Oxyphilie versteht sich also nur in Rücksicht auf die bei Anwendung neutraler Ge- mische zutage tretende prävalierende Chromophilie. 388. Eine Reihe basischer Farbstoffe, wie Methyl- violett, Thionin, Toluidinblau, Neutralrot, Safranin u. a. färbt bestimmte Substanzen, wie Schleim, Amyloid, Knor- § 389 — 393. Kernfärbung mit basischen Anilinfarben. 101 pelgrundsubstanz, nicht in der Farbe der zur Färbung benutzten Lösung (also des neutralen Farbsalzes, also violett oder blau bei den drei ersten, rot bei den zwei letzten) sondern metacliromatisch in der Farbe der Farbbase, nämlich rot bis purpur bei den drei ersten, gelb bei den zwei letzten. Nach Hansen (08) beruht die Metachromasie darauf, daß die genannten Gewebebestandteile die in den wässerigen Farblösungen vorhandenen, hydrolytisch ge- bildeten freien Moleküle der Farbbase im besonderen Grade aufspeichern und sich daher in deren Ton besonders stark färben. 389. Bei Färbungen mit Anilinfarbstoffen hat man ganz besonders auf die Herkunft der Farben zu achten, da gleichnamige Farben verschiedener Fabriken sehr oft ganz differente Eigenschaften haben. Am besten bezieht man die Farbstoffe von Grübler. 390. Eine Reihe von Farbmischungen ist in Form von Tabletten erhältlich, die vor Gebrauch nach Vorschrift ge- löst werden. Friedberger (16) gebraucht Farbstifte (her- gestellt von Altmann, Berhn NW 6), die für praktisches Arbeiten ganz brauchbar sind. Für exakte Untersuchungen sind sie wohl weniger geeignet. 391. Die im nachfolgenden angegebenen Anilinfär- bungen reichen für die gewöhnlichen Zwecke der Färbung aus. Färbemethoden, welche besonderen Aufgaben dienen, werden im speziellenTeil erwähnt. (S. auch im Sachregister: Färbemethoden.) b) Kernfärbung mit basischen Anihnfarben. 392. Safranin ist ein wertvolles Kernfärbemittel, vor allem für Präparate, die in chrom- oder osmiumhaltigen Flüssigkeiten fixiert werden. Sehr wichtig für das Gelingen der Färbung ist aber ein gutes Safranin. Das alte von Flem- ming benutzte ist nicht mehr erhältlich (Winiwarter 08). An seiner Stelleist das Safranin 20 (Grübler), I (de Haen) oder (Schuchardt) zu empfehlen. 393. Man löst 1 g in 100 ccm absoluten Alkohols und setzt einige Tropfen Anilinwassers (s. § 397) zu. Zum Gebrauch verdünnt man mit der gleichen Menge destillier- ten Wassers (Winiwarter und Sainmont 08). Die Schnitte werden hierin 24 Stunden gefärbt, mit dest. Wasser kurz abgewaschen und in abs. Alk. differenziert. Hierauf Xylol und Balsam. Resultat: Chromatin intensiv rot, besonders bei Objekten, die mit osmiumsäurehaltigen Lösungen fixiert wurden (Basichromatin. Heidenhain). 102 Kernfärbung mit basischen Anilinfarben. § 394 — 402. Mit schwach angesäuertem abs. Alk. (l^oo Salzsäure) geht die Differenzierung rascher vor sich. Die Säure muß durch reinen Alkohol wieder entfernt werden. Podwissotzki (87) nimmt statt Salzsäure pikrinsäurehaltigen abs. Alkohol. Von zahlreichen anderen Safraninlösungen führe ich noch folgende an: 394. Alkoholische Lösung von Flemming: Man löse 1 g Safranin in 100 ccm abs. Alk. und verdünne nach Lösung mit 50 ccm dest. Wasser. 395. Anilinwassersafranin nach Babes. Man löst 2 — 3 g Safranin in AniUnwasser bei Erwärmung auf 60'' C und fil- triert heiß durch ein wasserbenetztes Filter (Lösung nur einige Monate haltbar). 396. Schuberg empfiehlt eine Mischung der beiden letzt- genannten Lösungen zu gleichen Teilen. 397. Herstellung von AniUnwasser. Man schüttelt 5 — 10 ccm Anilin, puriss. mit 100 ccm Aqua dest. fest durch und filtriert durch ein mit Wasser angefeuchtetes Filter. 398. Liegen Präparate sehr lange in Alkohol, so läßt sich ihre Färbbarkeit für Safranin dadurch wieder herstellen, daß man sie 5 — 10 Min. mit verdünnter Flemmingscher Lösung beizt: 10 — 15 Tr. auf 5 ccm Wasser (Ssobolew 99). 399. Thionin wie Toluidinblau (F. Mayer 98) geben gute Kernfärbungen. Man färbt 12 — 24 Stunden in 1% wässeriger Lösung und differenziert in 96% Alkohol. Viel- fach genügt es auch schon, 10 — 20 Min. zu färben. Fi- xierung in Sublimat, Sublimatgemischen, Bouin, Flem- mingscher Lösung, auch absolutem Alkohol, (Altmann, Metzner u. a.). Schleim, Knorpelgrundsubstanz und Mastzellengranula färben sich metachromatisch. Die Thi- oninfärbungen sind gegen Alkohol äußerst empfindlich, etwas weniger die mit Toluidinblau. Auch im Kanadabal- sam blassen sie leicht ab. 400. Um die Färbung beständiger zu machen, empfiehlt Metzner (07 u. 15), die aufgeklebten und paraffinbefreiten Schnitte zunächst etwa 45 Min. in 3 — 5%iger wässeriger Eisenalaunlösung zu beizen. Nach Abspülen mit Wasser fäi'bt man 10 — 20 Min. in einer dünnen Lösung von Toluidin- blau und differenziert in 50%-Alkohol, bis keine Farbwolken mehr abgehen. Wenn sich die Schnitte ablösen sollten, so beizt man etwa 40 Stunden in einer alkoholischen Eisenalaun- lösung und färbt mit alkoholischer Farblösung. 401. Die Färbungen können auch mit 5% molybdän- saurem Ammoniak (5 — 10 Min.) fixiert werden. 402. Sehr wertvoll ist Methylgrün, das nach Pappen- heim (08) von allen Substantiv färbbaren oxyphilen und § 403—408. Mehrfachfärbung. 103 basophilen Substraten nichts als das Chromatin (Metazoen) färbt. Herstellung: lg Methylgrün wird in 100 ccm dest. Wassers gelöst und 25 ccm abs. Alk. zugegeben. Färbung: 10 Min. Bei längerer Dauer wird mit 20% -Alkohol auf das Doppelte oder mehr verdünnt. Nach der Färbung Ab- spülen in Wasser, Differenzieren in 70%. Alkohol (ca. 1 bis 2 Min.), abs. Alkohol (1 Min.), Xylol, Kanadabalsam. Leider ist die Haltbarkeit der Färbung oft gering. Wichtige Farbgemische mit Methylgrün siehe § 433 f. Methylgrün ist oft mit Methylviolett verunreinigt. Zur Entfernung der letzteren schüttelt mau mit Chloroform aus. 403. Über Verwendung bei frischen Geweben siehe § 513. 404. Bismarckbraun nach Weigert (78). Kernfärbung. Auch Knorpelgrundsubstanz wird intensiv gefärbt. Herstellung der Farblösung und Färben wie § 402 (Methylgrün). Farbton unschön. 405. Fuchsin (Magenta, Rubin basischer Farbstoff, nicht zu verwechseln mit Säurefuchsin und Rubin S). Anwendung wie Safranin. Nach Sereni besitzt es meta- chromatische Eigenschaften. (Schleim wird z. B. violett gefärbt.) 406. Oentianaviolett dient zur Kernfärbung z. B. in 1% wässeriger Lösung. Differenziert wird in 96%- Alkohol. Ebenso Methylenblau oder Kresylviolett R extra. Haltbarer sind konzentrierte wässerige Lösungen der be- treffenden Farbstoffe, zu denen man nach 1 — 2 Tagen das gleiche Volumen 96% -Alkohols setzt. Zur Färbung gibt man einige Kubikzentimeter in destilliertes Wasser. Bei sehr starker Überfärbung differenziert man in schwach essigsaurem Wasser. Dann abs. Alk. 407. Zur Herstellung der Grramschen Gentiana- violettlösung (etwa 10 Tage haltbar) setzt man zu 100 ccm Anilinwasser 11 ccm einer konzentrierten alkoholischen Lö- ,3ung von Genti anaviolett. Färbedauer 3 bis 5 Min., Ab- spülen mit Wasser, Aufgießen von Jodjodkaliumlösung (1:2:300) 2 Min., Abgießen der Jodlösung und Differen- zieren in absolutem Alkohol Xylol, Kanadabalsam. c) M ehrfach färbung. 408. Läßt man bestimmte Farben in Mischung (simultan) oder nacheinander (succedan) auf denselben Schnitt einwirken, so färben sich nicht etwa alle Gewobeteile des Schnittes in der Farbe der Mischung, sondern bestimmte Gewebeteile nehmen nur die eine, andere dagegen die zweite Farbe an. Je nach der Zahl der kombinierten Farben 104 Mehrfachfärbung. §409—410. spricht man dann von Doppel-, Dreifach- oder kurz von Mehrfachfärbungen. 409. Wenn ein Gemisch von zwei Farben einen Schnitt in gleichmäßiger Mischfarbe tingiert, so ist das keine Doppel- färbung in unserem Sinne. Nur ganz bestimmte Farben- zusammenstellungen geben Mehrfachfärbungen, die für die histologische Untersuchung von Wert sind. Eine richtige Mehrfachfärbung ist es z. B., wenn durch einen blauen Farbstoff, wie Hämalaun oder Toluidinblau, die Kerne in blauer Farbe und durch eine zweite sog. plasma- färbende, saure Farbe, wie Eosin, die übrigen Bestandteile des Präparates in roter Farbe voneinander geschieden werden. Keinen Wert hätte dagegen die Kombination zweier blaufär- bender Farbstoffe, wae z. B. Toluidinblau und Thionin. Durch Zusammenstellung mehrerer kernfärbender Farben können ferner verschiedene Teile des Kernes oder verschiedene Kernarten (z. B. sog. saure Kerne) auseinandergehalten werden. Anderseits kann man auch mehrere nicht kernfärbende Farben mit einer kernfärbenden kombinieren und dadurch drei- und mehrfache Farbunterschiede erzielen. Eine andere Reihe von Farben tingiert nur ganz bestimmte Gewebe, z. B. elastische Fasern. Auch sie werden bisweilen wieder mit anderen Farben, z. B. zur Kernfärbung, kombiniert. Im nachfolgenden ist eine Zusammenstellung der für allgemeine Zwecke zu empfehlenden Mehrfachfärbungen gegeben. 410. Eine der gebräuchlichsten Doppelfärbungen ist die Hämalaun -Eosinfärbung, die auch für den Anfänger von allen Doppelfärbungen zuerst einzuüben ist. Dazu werden zunächst die Kerne eines Präparates mit Hämalaun nach § 349 gefärbt und mit Wasser gut ausgewaschen, so daß die Kerne dunkelblau auf grauem, beinahe ungefärbtem Grunde hervortreten. Zur Plasmafärbung benutzt man eine 1% - Stammlösung von Eosin \\. g. (= wasserlöslich, gelblich) in dest. Wasser, die man zur Färbung noch mit der 3 — 10 fachen Menge dest. Wassers verdünnt. Darin färbt man die Schnitte 3 — 5 Minuten. Die Dauer der Fär- bung richtet sich nach der Konzentration der Lösung. Bei stärkerer genügt schon 1 Min., bei schwächerer färbt man entsprechend länger. Dann wird der Überschuß des Farbstoffes in Wasser gut ausgewaschen, bis sich das Wasser kaum mehr rot färbt. Hierauf kommen die Schnitte für etwa 2 Minuten in 80%-Alkohol, für 3—5 Min. in 96%- Alkohol und schließlich zur völligen Entwässerung auf 2 bis 3 Min. in absoluten Alkohol. Von hier werden sie in § 411—415. Mehrfachfärbung. 105 Xylol gebracht und nach 2 — ^3 Minuten in Kanadabalsani eingedeckt. Resultat: Kerne und Knorpel blau, alles übrige in verschiedenen Tonabstufungen rot. 411. Statt der wässerigen Lösung kann man auch eine 1% - Lösung in 90% - Alkohol nehmen. Die Färbe- dauer ist darin gewöhnlich etwas länger. 412. Da ein Teil der Eosinfärbung beim Auswaschen und Entwässern wieder ausgezogen wird (in schwachen Al- koholen mehr als in starken), so muß man bei ihr, ganz im Gegensatz zur Hämalaunfärbung, zunächst überfärben, also das Gewebe stärker färben, als es später sein soll. Man hüte sich jedoch vor zu starker "Überfärbung, da ein derartiges Präparat schmierig und undeutlich wird. Besonders der Anfänger neigt zu einer Überfärbung mit Eosin. in der irrigen Annahme, dadurch eine schärfere Trennung der Struk- turen erreichen zu können. Im übrigen ist eine Korrektion der Überfärbung durch entsprechend langes Ausziehen der Farbe mit 70%-Alkohol (evtl. mehrere Stunden) leicht mög- lich. Am längsten halten die eosinophilen Granula, Dotter- plättchen, Kernkörperchen und Blutkörperchen den Farb- stoff fest. Bringt man Schnitte aus alkahschen Flüssigkeiten in Eosin, so haftet die Farbe nur schlecht. 413. Der einfachen Eosinlösung wird von manchen eine 0,1 — 1% wässerige Lösung von Erythrosin oder von Jodeosin vorgezogen. Für distinkte Färbung von Faser- strukturen färbe man in ganz verdünnten Lösungen ca. 24 Stunden. Statt Hämalaun können natürlich auch alle anderen in § 344 — ^362 angegebenen kernfärbenden Hämatoxylin- gemische mit Eosin usw. kombiniert werden. 414. Zur Nachfärbung nach Hämalaun, insbesondere aber auch nach Eisenhämatoxylin empfehlen sich auch Säurefuchsin (Fuchsin S), Rubin S, Orange G oder Licht- grün. Man verwendet meist 0,5 — 1% wässerige Lösungen, ,die nach Zusatz von etwas Formol gut haltbar sind, Über- färbungen lassen sich durch Auswaschen mit Wasser leicht korrigieren. Sämthche in § 410 — 414 angeführten Doppel- färbungen sind sehr haltbar. 415. Sehr gebräuchlich ist, besonders in der patho- logischen Anatomie, die Färbung nach van Gieson. (Fi- xierung nach Müller, Zenker, Orth, in Alkohol, Sub- limat, Formol od. dgl.) Kernfärbuftg mit einem der Hä- matoxylingemische. Auswaschen, dann 3 — 5 Min. in ein Gemisch von konzentrierter wässeriger Pikrinsäure- lösung mit konzentrierter wässeriger Säurefuchsin- lösung (von letzterer so viel, daß eine dunkelgranatrote 106 Mehrfachfärbung. § 416—420. Farbe entsteht), kurz abspülen in Wasser, 96% -Alkohol, absoluter Alkohol, Xylol, Kanadabalsam; oder man färbt 1/2 — 1 Min., trocknet mit mehrfach gefaltetem glatten Filtrierpapier ab, dann gleich 96% -Alkohol usw. Die Me- thode ist einfach und gibt dabei schöne Dreifachfärbung: Kerne schwarzbraun; Bindegewebe leuchtend rot; Mus- kulatur u. a. gelb; Amyloid, Kolloid, Hyalin und Schleim in besonderen Tonabstufungen. Nachteilig ist, daß be- sonders die Fuchsinfärbung schon nach einigen Monaten abblaßt. 416. Bei der vorausgehenden Kernfärbung mit Hämalaun od. dgl. überfärbe man die Schnitte etwas, da die Pikrinsäure zum Teil entfärbend wirkt. 417. Die Mengenangaben in der obigen Original- vorschrift von van Gieson sind sehr unbestimmt, wes- halb ich besonders folgende Modifikation nach Benda empfehle: Stammlösung: gesättigte wässerige Lösung von pikrinsaurem Ammoniak 95 ccm -|- 1% wässerige Säure- fuchsinlösung (oder Rubin S) 5 ccm; unbegrenzt haltbar. Zum Gebrauch gibt man auf 10 ccm der Stammlösung 1- — 2 Tropfen einer gesättigten, wässerigen Pikrinsäure- lösung. Gut mischen. Will man die Schnitte gelber, dann 3 — 4 Tropfen. Färbungsdauer 10 — 15 Min., dann direkt in 80%-Alkohol usw. Kein Wasser! Die vorausgegangene Kernfärbung mit Hämatoxylin wird durch diese Lösung nicht angegriffen. 418. Sehr gut ist auch die Weigertsche Anwen- dung der van Gieson- Färbung vgl. §363. Dabei wird die Neuroglia, im Gegensatz zum van Giesonschen- Verfahren, nicht gefärbt. 419. Nachfärbung mit Rubin- S-Ammoniumpikrat nach Apathy. Vorfärbung in Hämatoxyhn lA (§350), Abspülen in dest. Wasser oder in Leitungswasser, wenn die Tinktion dunkler werden soll. Sodann färben in: Konzentr. Ammonium- pikratlösung in l%iger Lösung von Natr. salicylic. 100 ccm, dazu 2 ccm einer 10% -Rubin S-Lösung (= Säurefuchsin). Nach wenigen Minuten spült man in dest. Wasser mit Zusatz von etwas Ammoniumpikrat ab, entwässert flüchtig mit 90^0 -Alkohol und bringt durch Chloroformalkohol und reines Chloroform möglichst rasch in Chloroform- Kanada- balsam. Ich selbst ziehe vor, die Schnitte aus dem 90%-Al- kohol in Terpineol, Xylol und Xylol-Kanadabalsam zu bringen. 420. Die Delamaresche Mischung färbt gleichzeitig Kerne violett, Protoplasma und Muskel gelb, kollagenes Bindegewebe rot, elastische Fasern schwarz. Herstellung: 1 g Orzein wird in 50 ccm abs. Alk. + ^ ccm Salzsäure § 421—425. Mehrfachfärbung. 107 gelöst und mit dem gleichen Volumen folgender Lösung gemischt: saures Hämatoxylin nach Ehrlich (s. §353) 2 ccm, gesättigte wässerige Lösung von Säurefuchsin (Grüb- ler) 1 ccm, gesättigte wässerige Lösung von Pikrinsäure 200 ccm. (Die Mischung hält sich nicht über eine Woche.) Mit Wasser aufgeklebte Schnitte von Alkohol- oder For- molpräparaten werden in der Delamareschen Mischung 30 Min. bei 45^ C gefärbt, mit etwas saurem Wasser ab- gespült, (4 — 5 Tropfen HCl auf 100 ccm HgO), mit gewöhn- lichem Wasser gewaschen und durch Alkohol und Xylol in Kanadabalsam gebracht. 421. Nach Karminkernfärbung wird sehr häufig Pikrinsäure als Kontrastfarbe benutzt, häufig als gesättigte wässerige Lösung (in manchen Fällen auch in alkoholischer Lösung), die für die Färbung im Verhältnis 1 : 3 mit Wasser verdünnt wird. Bei Schnitten genügt eine Nachfärbung von 2 — 5 Minuten. Dann auswaschen mit Wasser, Alkohol, Xylol, Kanadabalsam. Beim Auswaschen beachte man, daß die Pikrinsäure in fließendem Wasser rasch und fast vollständig weggeht; man kann jedoch schon mit bloßem Auge den Moment erkennen, in welchem der Schnitt eben noch einen gelben Ton besitzt. Auch durch Alkohol und Xylol wird sie noch ausgezogen Die Nachfärbung mit Pikrinsäure kann auch im vStück geschehen; Dauer je nach der Größe des Objektes 2 — 24 Stun- den. Dabei wirkt die Pikrinsäure auf Präparate, welche mit Boraxkarmin durchgefärbt sind, differenzierend, so daß also die Stücke aus Boraxkarmin statt in salzsauren Alkohol direkt in Pikrinsäure übertragen werden können. Man nimmt dann eine gesättigte Lösung in 70*^0 -Alkohol. 422. Pikrokarmin, nach P. Mayer (97) ein inkonstantes Gemisch von Ammoniumpikrat, Ammoniakkarmin und freiem Ammoniak, wurde von Ran vi er in die Technik eingeführt. Das Gemisch färbt sehr ungleichmäßig, ebenso die zahlreichen '"Modifikationen, und ist besser durch eine Färbung nach §421 zu ersetze^n. 423. tndigokarmin kann nach P. Mayer (96) in einfacher Weise angewandt werden, indem man eine Lö- sung von 0,1 g Indigokarmin in 50 ccm Wasser (oder 5% -Alaunlösung) mit dem 4 — 20 fachen Volumen von Kar- malaun oder Hämalaun vermischt. 424. Von Apathy (96) empfiehlt Indigokarmin zur Nachfärbung nach Safranin. (Fixierung in Hermannscher Flüssigkeit.) 425. R. y Cajal (97) färbt zuerst in gesättigter wässeriger Magcutalösung, wäscht in Wasser, bis die Farbe nicht mehr ab- 108 Mehrfachfärbung. § 426—431* geht, und färbt dann 5 Min. in gesättigter wässeriger Pikriii- säurelösung, in der auf 100 com 0,4 g Indigokarmin gelöst wurde. Waschen in Wasser, zu dem eine Spur Essigsäure zugesetzt wurde; rasche Entwässerung mit Alkohol; Xyh)l, Kanadabalsam. Resultat: Azidophile Substanz feuerrot, basophile grau bis himmelblau. 426. Poll (08) färbt 5 Min. in einer Mischung von ges. wässeriger Pikrinsäure 100 com und Indigokarmin 0,4 g, dann ohne oder nach kurzem Abspülen in Wasser in konz. Wässer. Magentarot (5 Min.) und differenziert in abs. Alk. Färbung für Mitosen, Knorpel, Schleim,' Ossifikation usw\ sehr elektiv. 427. Pikroindigokarmin. R. Krause (11) färbt nach Karmalaun, Parakarmin oder Safranin 5 — 10 Min. mit lg Indigokarmin in 300 ccm konz. wässer. Pikrinsäure; auswaschen in 70% -Alkohol usw. Kerne rot, Bindegewebe leuchtend blau, Zellprotoplasma und Muskulatur gras- grün. 428. Oppel (12) bringt Zelloidinschnitte von Formalin- präparaten nach Stückfärbung mit Boraxkarmin auf 1 14 Min. in eine Lösung von 100 ccm konz. wässer. Pikrinsäure und 3 g Indigokarmin (frisch hergestellt, oft geschüttelt), dann für 1 Min. in Pikrinsäure-Säurefuchsin (nach Weigert §418), 5 Min. in mehrfach gewechseltes dest. Wasser, 2 Min. in 96%- Alk., Karbolxylol, Kanadabalsam, Resultat: Kerne karmin- rot, Knochen blau, Muskel braun, Blut grün, Bindegewebe fuchsinrot resp. blauschwarz in verschiedenen Abstufungen usw. Die Färbung soll haltbar sein. 429. Karmin-Bleu de Lyon (Baumgarten). Bleu de Lyon ist löslich in Alkohol, unlöslich in Wasser. Rose löst die Farbe in absolutem Alkohol und verdünnt dann einige Tropfen der Lösung so stark mit absolutem Alkohol, daß die Flüssigkeit kaum mehr blau erscheint. Darin wer- den die im Stück oder Schnitt mit Karmin vorgefärbten Präparate 24 Stunden nachgefärbt. 430. Bleu de Lyon färbt nach Tonkoff viel rascher und intensiver, wenn man zur Farbe Jodtinktur zusetzt (1 Tr. auf 30 ccm Farblösung) oder die Schnitte vor der Färbung mit sehr verdünnter Jodtinkturlösung behandelt. Wie ich beobachten konnte, bleichen die Präparate bei Jodzusatz rascher aus. 431. Skrobansky (04) färbt mit Boraxkarmin vor und dann mit Bleu de Lyon-Pikrinsäure nach. Zu 100 ccm Wasser setzt man 4 ccm einer konz. alkohol. (95 °o) Bleu de Lyon- lösung und 10 ccm einer gesättigten wässerigen Pikrinsäure- lösung. Man färbt 2 — 3 Min., dann durch 80%, abs. Alkohol und Xylol in Kanadabalsam. 4 § 432—436. Mehrfachfärbung. 109 432. Schuberg (03) bringt mit Borax oder Parakarmiii vorgefärbte Stücke in eine 0,5%- Osmiumsäure. Nach 12 bis 24 Stunden kommen die Präparate ebensolange in Holz- essig, der mit dem gleichen oder doppelten Volumen Wasser verdünnt ist. Dann Wässern usw., Einbetten. Nach der Karminfärbung darf nicht zu stark differenziert werden, da auch der Holzessig die Farbe etwas auszieht. Über die nachfolgenden, in § 433, 434 und 435 ange- führten Farbgemische hat Pappenheim eine wichtige Studie geschrieben (08). 433. Die Methylgrün-Pyronin-Doppelfärbung gestattet eine morphologische Trennung zwischen Ghromatin und Plastin der Zelle (Chromatin grün, karyogenes wie plas- matisches Basi- und Oxyplastin dagegen rot) (s. § 434). Die Methylenblau-Eosin - Doppelfärbung differenziert ganz allgemein basophile (blau) von oxyphiler Substanz (rot), unterscheidet aber innerhalb der basophilen nicht das Basiplastin vom Oxyplastin (s. § 714). Die Methylgrün-Pyronin- Orange-Dreifachfärbung trennt zwischen Chromatin (grün), Basiplastin (rot) und Oxy- plastin (orange) (s. § 435). 434. Methylgrün-Pyronin nach Pappenheim-Unna. Schnitte von Alkohol-Sublimat, oder nach Orth oder Helly fixiertem Material werden gefärbt in: Methylgrün 00 Cryst. gelblich (Grübler) 0,15 g; Pyronin 0,25 g; 96%- Alkohol 2,5 ccm; Glyzerin 20,0 ccm; krist. Karbolsäure 0,5 g; dest. Wasser 100 ccm. Man färbt 10—25 Minuten, spült einige Sekunden in Wasser ab und differenziert in 70% -Alkohol. Sodann abs. Alk., Xylol, Balsam; Re- sultat: Chromatin: grün. Plastin: rot. 435. Methylgrün - Pyronin - Orange - Neutralgemisch nach Grosso (02). Man mischt von gesättigten wässerigen Farb- ^. lösungen von Methylgrün 3,2 ccm, Pyronin 6,0 ccm, und Orange 'Gl ccm mit 75 ccm destillierten Wassers in der genannten Reihenfolge. Nach 24 Stunden wird die Lösung, die sehr haltbar ist, zum Gebrauch filtriert. Die von Alkohol oder formolfixiertem Material stammenden Schnitte kommen auf 5 — 10 Min. in die Farbe, sodann abspülen in destilhertem Wasser, abtrocknen mit Filtrierpapier , differenzieren in absolutem Alkohol, bis fast keine Farbe mehr ausgezogen wird, Xylol, Kanadabalsam. Resultat vgl. § 433. 436. Methylgrün-Fuchsin- S- Orange ist ein neutrales Gemisch, das gewöhnhch unter dem Namen Triazid be- kannt ist. Die ursprüngliche Ehrlich-Biondische Lö- sung ist : von den gesättigten wässerigen Lösungen werden IIÖ - Mehrfachfärbung. §437—438. gemischt 10 ccm Orange G, 1 com Fuchsin S, 3 ccm Methyl- grün. 437.. M. Heidenhaiii (92) modifiziert ein ähnhehes, von R. Heidenhain (88) empfohlenes Gemisch wie folgt: Von den gesättigten wässerigen Lösungen, welche während mehrerer Tage öfters geschüttelt wurden, werden gemischt: 100 ccm Orange, 20 ccm Fuchsin S, 50 ccm Methylgrün. Zur Färbung wird 1 Teil der Lösung mit 60 — 100 Teilen Wasser verdünnt. Es wird 24 Stunden gefärbt, mit Wasser gespült, kurz mit Alkohol ausgezogen, Xylol, Balsam (Sub- hmatpräparate). 438. Die beste Vorschrift gibt Krause (11). Da man bei ihrer Befolgung mit Leichtigkeit sehr farbenprächtige Präparate erhält, so sei sie ausführlich wiedergegeben. Die Farbstoffe müssen aus der Aktiengesellschaft für Anilin- fabrikation zu Berlin stammen (auch von Grübler erhält- lich), und zwar nehme man die Marken Methylgrün N M P, Säurefuchsin SMP und Orange G M P. 3,4 g der ersten, 4,2 g der zweiten und 3,0 g der dritten Substanz verreibt man in einer Porzellanreibschale auf das sorgfältigste zu einem ganz gleichmäßigen Pulver, das in einem Erlen- meyerkölbchen aus bestem Jenenser Glas mit 100 ccm dest. Wassers Übergossen wird. Durch gewöhnliches Glas wird die Farbe rasch verdorben. (Alkali !)i) Man läßt die Lösung gut verkorkt unter öfterem Umschüt- teln 2 — 3 Tage bei ca. 35^ C stehen. Nach völhger Lösung resultiert dann eine dunkelbraune Flüssigkeit mit einem Stich ins Rötliche. Diese langhaltbare Stammlösung wird zur Färbung in folgender Weise verdünnt und angesäuert. In eine Schüttelmensur von 100 ccm Inhalt gibt man 1 ccm Essig- säure, füllt mit destilliertem Wasser auf 100 ccm auf, schüttelt gut durch und gießt den Inhalt aus. 'Die an der Wand haf- tenden Säurespuren genügen zur Ansäuerung. Dann mißt man in einem zweiten kleinen Meßzylinder 5 ccm der Stamm- lösung ab, spült sie mit destilhertem Wasser vollständig in den angesäuerten Zyhnder und füllt auf 50 ccm auf. (Lösung einige Tage haltbar.) Die Färbedauer ist meist von geringem Einfluß, es genügen schon 10 Min., man kann aber auch 24 Stunden färben. Nach kurzem Abspülen in 0,5%-Essig- säure überträgt man in 70%-Alkohol, wo starke Farbwolken abgehen. Man soll den Aufenthalt in ihm nicht zu lange *) Um den Einfluß des Glases auf die Farblösung ganz auszuschalten, gießt man am besten in die etwas erwärmte Flasche heißes Paraffin, schwenkt herum und läßt ablaufen. Nach dem Erkalten ist die Glaswand mit einer dünnen Paraffin- schicht überzogen. Dies ist auch für viele andere Farblösungen von Vorteil. § 439 — i42. Mehrfachfärbung. 111 ausdehnen, sondern den Schnitt, sobald er rot geworden ist, durch absoluten Alkohol in Xylol übertragen. Was das zu verwendende Material anlangt, so muß man zwischen Gefrier- und Paraffinschnitten unterscheiden. Von ersteren geben beinahe alle Fixationen vorzüghche Resultate, von Paraffinschnitten nur in Sublimat oder Sublimatgemischen fixiertes Material. Bei Celloidinmaterial ist vor der Färbung das Celloidin zu entfernen. Resultat: Chromatin blaugrün, ebenso Knorpel und Schleim; Mastzellengranula blauviolett; Nukleolen, Kernsaft, Zentriolen, Sphären, Spindeln, Zell- protoplasma, koUagenes und elastisches Gewebe, oxyphile Granulationen, Knochen, Zahnbein rot in verschiedenen Abstufungen. Rote Blutkörperchen orange. Leider blaßt die Färbung häufig bald ab (vergl. auch § 729). 439. Morel und Doleris (02) geben zum Triazid 8% Formol und l%o Eisessig. Dadurch soll das Methylgrün in den Kernen gut fixiert werden. 440. Für Übersichtsbilder wie für spezielle Zwecke (vgl. § 739) empfiehlt sich sehr die von Dominici angegebene Orange-Eosin-Toluidinblaiifärbung. Fixierung: Sublimat-, Pikrinsäure- oder Formolgemische (besonders nach Orth (§132) oder Maximow (§186), abs. Alk. Färbung: Die Schnitte kommen zuerst für 20 — ^30 Min. in eine Orange- Eosinlösung (0,5 g Eosin w. g. -|- 0,6 g Orange G in 100 com dest. Wasser). Sodann werden sie in 60%-Alkohol kurz abgespült und auf % — 2 Min. in Toluidinblau gebracht. (0,5 g Toluidinblau auf 100 com dest. Wasser.) Dann differenzieren in 96% - Alkohol , bis keine Färb wölken mehr abgehen, abs. Alkohol, 2 — 3 Portionen reinstes Xylol, Balsam. 441. Tischkutin gebraucht unter sonst gleichen Bedingungen statt obiger Orange-Eosinlösung eine Mischung von 10 ccm einer zur Hälfte mit Wasser verdünnten fil- trierten, konz. Wässer. Lösung von Orange und 2 ccm einer ^konz. Lösung von Jodeosin in abs. Alk. Die Färbung wird darin noch kontrastreicher. 442. Sehr empfehlenswert ist ferner die Azur-Eosin- färbung in der von Nocht für Schnitte empfohlenen Mo- difikation. (Vgl. Maximow 09). Fixierung am besten nach Orth, Maximow oder in abs. Alk., doch sind auch andere Sublimat- und Formolgemische zulässig. Färbung: Man bereitet zwei einige Zeit haltbare Stammlösungen: A. wässerige Lösung von Eosin w. g. (Grübler) 1:1000, B. wässerige Lösung von Azur II (Grübler) 1:1000. Zur Färbung werden unmittelbar vor Gebrauch 10 ccm der Lösung A mit 100 ccm Wasser verdünnt ; dazu setzt man 112 Mehrfachfärbung. §443—446. unter Umrühren mit einem Glasstab 10 ccm der Lösung B. Man färbt 6 — 12 — 24 Stunden. Sodann differenzieren in 96% -Alkohol bis keine blauen Farbwolken mehr abgehen, Yo Min. abs. Alk., 3 Portionen reinsten Xylols, Kanada- balsam. Resultat: Protoplasma bläulich, in verschiedenen Abstufungen, Basichromatin dunkelblau, Oxychromatin rosa, Nukleolen rötlich violett, Hämoglobin leuchtend rosenrot, azidophile Granula, Sekretgranula grellrot usw, 443. Tritt das Eosin zu wenig hervor, wie z. B. bei Amphibienlarven, so mischt man Eosin- und Azur- lösung in folgendem Verhältnis: 16 ccm Eosinlösung: 80 ccm Wasser : 8 ccm Azurlösung. 444. Wenn gleich nach Mischung der Lösungen ein grober blauer Niederschlag auftritt, so ist die Lösung un- brauchbar. Meist trägt daran das zur Herstellung verwendete destillierte Wasser schuld; dasselbe muß ganz neutral sein. Ein während längerer Färbung entstehender Niederschlag ist unschädlich. 445. Giemsa (10a) fixiert mit Sublimatalkohol (konz. Wässer. Suhl. -Lösung 2T., abs. Alk. 1 T. nach Schau- dinn), bettet in Paraffin ein, behandelt die Schnitte mit Jod und Natriumthiosulfat und färbt nach gründlichem Auswässern (zuletzt dest. Wasser!) mit frisch verdünnter Giemsalösung (1 Tropfen auf 1 ccm, bei längerer Färbe- dauer auf 2 ccm dest. Wasser) 2 — 12 Stunden, spült in dest. Wasser und führt durch folgende Reihe: a) Azeton 95 Jj- Xylol 5 ; b) Azeton 70 + Xylol 30 ; c) Azeton 30 : Xylol 70; d) reines Xylol; e) Zedernholzöl. Die fertige Giemsa- lösung ist bei Grübler erhältlich. Manchmal empfiehlt es sich auch, zwei Tropfen der Lösung auf 1 ccm Wasser zu nehmen (s. dazu die wichtigen Angaben in § 717f). 446. Panoptisches Gemisch (kombinierte May-Giemsa- färbung nach Pappenheim (12). Fixation nach Orth od. Helly. Färbung: a) Vorfärbung in wässerig verdünnter alkohoHscher May- Grünwald- oder Jennerlösung (IT. zu 8 T. dest. Wass.; vgl. § 714) 20 Minuten bei 35« C; b) Um- bzw. Nachfärbung in wässeriger Giemsalösung (10 Tropfen zu 15 ccm dest. Wass.; vgl. § 717) 40 Minuten bei 35« C; c) kurzes Differenzieren in verdünnter Essigsäure (5 — 6 Tropfen Eisessig : 100 ccm dest. Wass.); d) Auswaschen in dest. Wass.; e) Abtrocknen mit Fließpapier; f) Entwässern in Azeton -|- abs. Alk. aa; g) Xylol, neutraler Balsam. Die Methode eignet sich wegen ihrer scharfen Differenzie- rung von oxychromen, neutrochromen und basochromen Sub- stanzen nicht nur für hämatopoetisches Material, sondern auch § 447 — 449. Mehrfachfärbung. • 113 für Übersichtsbilder sonstigen Materials. Für Chromatin- studien ist sie weniger geeignet. Die Verdünnung der Farblösungen hat unmittelbar vor Gebrauch zu erfolgen. Während der Färbung sind die Lö- sungen gut zu bedecken. Das zum Entwässern benutzte Aze- ton muß säurefrei sein (vgl. § 740). Im Übrigen sind hier wie bei der nächsten Färbung auch noch die in § 709 — 721 gegebenen Vorschriften zu beachten. 447. Panchromfärbung nach Pappenheim. Fixation wie § 446. Jodierung und Ent joden mit Thiosulfat. Fär- bung: Vorfärben in wässerig verdünnter alkoholischer May Grünwaldlösung (1 T. : 8 T. dest. Wass.) 10 Minuten; b) Nachfärben in wässeriger Panchromlösung (10 Tropfen zu 10 ccm dest. Wass.) 20 Minuten; c) Differenzieren in 0,l%iger wässeriger Pikrinsäure, bis der Schnitt rötlich aussieht; d) Auswaschen in dest. Wasser (ca. 5 Minuten), Abtrocknen mit FHeßpapier. Azetonxylol (3:7); Fließ- papier; Azetonxylol. Xylol, Neutraler Balsam. 448. Das Panchrom- Gemisch besteht aus: Methylen- blau 1,0; Toluidinblau 0,5; Azur I 1,0; Methylenviolett 0,5; Eosin 0,75; Methylalkohol 250,0; Glyzerin 200,0; Azeton 50,0. (Es wird am besten fertig von Grübler be- zogen.) 449. Salkind (12) empfiehlt folgendes polychromes Farbgemisch (T-E-N), das nach seinen Angaben nach jeder behebigen Fixierung mit Erfolg anwendbar ist: Man mischt folgende vier Lösungen in der angegebenen Reihenfolge: 1. Gesättigte Lösung von Toluidinblau in dest. Wasser mit 3% Formolgehalt: 12 ccm; 2. 90 %iger Alkohol: 8 ccm und Azeton: 4 ccm; 3. gesättigte Lösung von Naphtholgelb in 90%igem Alkohol: 2 ccm; 4. gesättigte Lösung von Ery- throsin pur. in 90 % igem Alk. : 3 ccm. Dazu gibt man sogleich 5 — 10 ccm dest. Wasser und läßt stehen. Nach einigen Mi- nuten muß die Flüssigkeit rein blau (mit einem Stich ins " Violette) sein und keinen suspendierten Niederschlag ent- halten, ev. muß filtriert werden. Zur Färbung kommt das Präparat auf 5 — 10 Minuten (oder länger) aus abs. Alkohol in die Farbe, dann in abs. Alkohol, Xylol, Balsam. Resultat: Knorpel, Schleim, Mastzellkörner: violett; Chromatin, baso- phile Substanzen: blau; Blut: grün; Keratin, Chitin: gelb; Muskeln: orange; azidophile Substanz: rot; neutrophile Gra- nula: grau. Ich persönlich bekam weder mit dem von Grübler bezogenen, noch mit den unter den verschiedensten Varia- tionen hergestellten Gemischen derartige Resultate. Von großem Einfluß erschien mir u. a. auch die Art der Fixierung, durch die die Farbtöne nach meinen Beobachtungen sehr stark beeinflußt werden. Romeis, Taschenh. rl. mikrosk. Technik. 8. Aufl. g 114. Vitale Färbung. §460-461. 10. Kapitel. Vitale Färbung. 450. Als vitale Färbung bezeichnet man Färbungs- methoden, welche am lebenden Tier (oder an lebenden Zellen) mit Erfolg vorgenommen und von diesen ohne sichtlichen Schaden längere Zeit ertragen werden (Fischel 10). Nur in einzelnen Fällen handelt es sich dabei um die Färbung präformierter Strukturen (z. B. Fibrillen, Mi- tochondrien, Kerne); bei den meisten Methoden treten da- gegen im Protoplasma bestimmter Zellen Farbstoffkörnchen auf, die besonders bei Färbung mit sauren Farbstoffen erst unter dem Einfluß der Farbstoffe entstehen (v. Möllen- dorff (15), Schulemann (17) u. a.). Das Absterben der Zellen hat meist eine Veränderung der Färbung zur Folge, die nun meist auf andere, während des Lebens ungefärbte Zellbestandteile, z. B. den Kern, übergeht. Dieser Wechsel ist für die Beurteilung der Färbung (intra-, supra- oder po st vital, Arnold (14)) von großer Bedeutung. Die Auf- gaben und Ziele der Vitalfärbung sind sehr mannigfaltig. Sehr wertvoll ist sie (meist als Supravitalfärbung) zur Dar- stellung nervöser Elemente (Ehrlich, Dogiel u. a.). Fischel, Arnold, Goldmann, Asschoff, v. Möllendorff u. a. bahnten mit ihr neue Wege für histologische und besonders histo- physiologische Untersuchungen. (Auffindung besonderer, morphologisch kaum unterscheidbarer Zelltypen, Erken- nung von Sekretionsvorgängen usw.) Von besonderer Be- deutung ist ferner, daß zwischen der Verteilung der Farb- stoffe und jener gewisser Arzneimittel große Ähnlichkeit besteht (Schulemann). 451. Nach Schulemann (17) können chemische Re- aktionen zwischen Zelle und Farbstoff nicht die Ursache der Vitalfärbung sein (Versagen der Seitenkettentheorie). Dagegen besteht weitgehende Übereinstimmung zwischen dem physiko-chemischen Verhalten der Farbstofflösungen und ihrem Vitalfärbungsvermögen. Der Vorgang der Vital- färbung setzt sich zusammen aus 1. der Verteilung der Farbstoffe im Tierkörper, 2. aus ihrer Speicherung in den vital färbbaren Zellen. Für Punkt 1 ist das physiko-che- mische Verhalten der Farbstofflösungen maßgebend. Bei geringem oder fehlendem Diffusionsvermögen kommt es nur am Injektionsort zu einer Vitalfärbung. Mit wachsen- der Diffusionsgeschwindigkeit steigt das Vermögen, all- gemein vital zu färben, so daß man bei einer gewissen mittleren Diffusionsgeschwindigkeit zu allgemein wirkenden Vitalfarbstoffen gelangt, die für histologische Untersuchun- §452—454. Vitale Färbung. 115 gen besonders geeignet sind; bei sehr hoher Diffusions- geschwindigkeit geht dagegen Färbung und Entfärbung innerhalb weniger Stunden vor sich, wobei der Organismus nur noch diffus durchtränkt wird. Für die Speicherung der Farbstoffe in den vital färbbaren Zellen (Punkt 2) können diese physikalischen Gründe allein nicht ausreichend sein. Hier spielen wahrscheinHch (ähnlich wie bei der Phago- zytose) auch noch Oberflächenspannungsänderungen an den Zeilgrenzen eine Rolle. Unter dem Einfluß der diffus ins Protoplasma gelangenden Farbstofflösung kommt es zu- nächst zur Bildung von Vakuolen, in denen sich mehr und mehr der Farbstoff konzentriert. Gelangen genügende Farbstoff mengen in das Protoplasma, und neigt der Farb- stoff an sich zur Molekülaggregatbildung, so wird mit wachsender Konzentration die Polymerisation der Farb- stoffe fortschreiten, bis es endlich zur Bildung mikro- skopisch sichtbarer Konkremente kommt. Wachsen diese weiter, so füllen sie unter Apposition mehr und mehr die Vakuole aus, bis sie frei als Farbstoffkorn im Protoplasma hegen. 452. Die Farbstoffe können auf die verschiedenste Weise dem Organismus einverleibt werden, so durch Fütterung vom Munde oder vom Darme aus, durch Einreibung in die Haut (gewisse Arzneistoffe, Tätowierung), durch Ein- spritzung in die Blut- oder Lymphbahn (intravenös, sub- kutan, pleuroperitoneal usw.). Wassertiere können direkt in toto in die Farblösung gebracht werden. Ferner können auch Organe oder Organfragmente, solange solche lebend erhalten werden können, in entsprechender Weise gefärbt werden (Einlegen in Farblösung, Einspritzung derselben durch die Blutgefäße, Durchrieselung unter Sauerstoff zufuhr usw.). Um einzelne Zellen unter dem Mikroskop zu färben, kann man auch etwas Farblösung auf dem Deckglas antrocknen lassen und dieses dann auf das flüssigkeitbedeckte Präparat ^ legen. Von den verschiedenen, der Vitalfärbung dienenden Methoden seien als wichtigste die folgenden angeführt: 453. Methylenblau findet, von Ehrlich (85) dazu zu- erst empfohlen, ausgedehnte Verwendung zur vitalen Ner- venfärbung bei Wirbeltieren. (Darstellung der gebräuch- lichsten Methoden siehe § 1043—1048.) 454. Zur Färbung des Nervensystems niederer Tiere (Cölenteraten, Würmer, Mollusken, Tunikaten usw.) nacli Apathy, Bethe, Freidenfeld, Retzius u. a. wird eine erforder- liche Menge der 1 % - Stammlösung von Methylenblau dem Wasser, in dem das Tier untergebracht ist, zugesetzt. Lö- 8* 116 Vitale Färbungen. § 455—462. sungen von 1 : 100 bis 1 : 1000 und schwächere geben die besten Resultate (Dogiel 10, Michailow 10). Auch wurden Methylenblaulösungen in die Organe und Körperhöhlen ein- geführt (Fütterung oder Injektion) und so Färbungen er- zielt. 455. Neutralrot (von Ehrlich in die Technik ein- geführt) kann zur Vitalfärbung per os, subkutan oder intravenös verabreicht werden. So färben sich z. B. Kaul- quappen oder Tritonenlarven, welche man statt in Wasser in einer Neutralrotlösung 1 : 10000 bis 100000 hält (Fischel), in 1 — 2 Tagen dunkelrot. Die Färbung beruht auf dem Auftreten roter Granula im Zellprotoplasma (Kerne un- gefärbt!). 456. Zur Untersuchung gewöhnlicher Zupfpräparate kann man der physiologischen Kochsalzlösung Neutralrot zusetzen. Durch Alkali wird das Rot des Farbstoffes in Gelb umge- wandelt, wodurch unter Umständen Schlüsse auf die Reak- tion eines gefärbten Zelleinschlusses möglich werden. An fixierten Objekten färben sich die basophilen Substanzen, wie Chromatin, Nißlsche Granula, Schleim, Knorpel usw. rot, die azidophilen Bestandteile gelb, die Mastzellengranula orange. 457. Arnold (11) verfütterte Neutralrot zur Granula- färbung im Magen und Darm. Fixierung durch Formoldämpfe nach Groß. 458. Nach Loeb L. (07) färben sich Zellen (Eier von Asterias) in Lösungen von Neutralrot, Eosin, Methylenblau usw. verschieden, je nachdem sie sich dabei im Licht oder im Dunkeln befinden. 459. Cesaris-Demel (09) bringt zur Frischfärbung Bril- lantkresylblau und Sudan III in trockenem Zustand an das Plasma heran, so daß sie sich direkt im Plasma lösen und an denjenigen Teilen fixieren, für welche sie eine Affinität haben. 460. Lange bekannt ist die schon von Lieberkühn, Köl- liker u. a. zum Studium des Knochenwachstums benutzte Eigenschaft des Krapps (Wurzel von Rubia tinctorum), bei Verfütterung lebende, neu sich bildende Knochensubstanz zu färben (s. § 910). Ebenso wirkt das aus dem Krapp ge- wonnene, wie auch das synthetisch hergestellte Alizarin. Gottheb (14) färbt durch parenterale Einverleibung von ah- zarinsulfosaurem Natrium elektiv das ganze Knochensystem. 461. A. Fischel (08a) erzielte bei Cladoceren durch Zu- satz von Alizarin, sicc. zu dem Wasser, in dem die Tiere leben, eine vitale und gleichzeitig spezifische Nervenfärbung. Die Färbung tritt bei einigen Tieren schon nach Stunden ein. 462. Nilsson (09) färbte bei Würmern in konz. Lösung von Alizarin in 12 — 24 Stunden auch Drüsensekret und Blut- gefäße. § 463—467. Vitale Färbung. 117 463. Die Vitalfärbung der Mitochondrien ge- lang zuerst Michaelis (00) mit Janusgrün; Cowdry (14) empfiehlt dazu das Janusgrün der Höchster Farbwerke 1 : 10000 in 0,85% NaCl; bei der Färbung muß der Luft- sauerstöff genügend Zutritt haben. Bei Blut bringt C. einen Tropfen der Farblösung auf einen erwärmten Objekt- träger, setzt einen Tropfen Blut zu und legt, ohne zu mischen, sofort ein Deckglas auf. Die Färbung hält 1 bis 2 Stunden 464. Nach Lewis W. H. and M. R. (15) ist Janusgrün selbst in Verdünnung 1 : 200000 für die Zellen noch giftig, so daß sie in wenigen Stunden absterben. Debeyre (12) färbt mit einer Mischung von Janusgrün und Neutralrot gleichzeitig Mitochondrien und Sekretkörnchen. 465. Goldmann (09 und 12) benutzt Trypanblau oder Pyrrolblau zur Vitalfärbung. Der Farbstoff wird in l%iger Lösung in Wasser oder besser in physiologischer Kochsalz- lösung subkutan oder intraperitoneal injiziert (1 ccm Lösung pro 20 g Körpergewicht). Nach der Injektion wird der Farbstoff zur Beschleunigung der Resorption durch leichtes Massieren verteilt. Die Injektionen werden in mehrtägigen Abständen solange wiederholt, bis das Tier ganz blau ist (bei Mäusen z. B. 10 — 12mal). Fixierung in 10%iger For- mollösung. Gefrierschnitte. Besonders Trypanblau verträgt aber auch Paraffineinbettung. Schulemann (12) fixiert in 20 — 25%iger Formollösung. Trypanblau kann nach Tscha- schin (13) ohne Schaden auch intravenös gegeben werden (bei Kaninchen z. B. 10 ccm einer l%igen Lösung in 0,85% iger NaCl-Lösung, alle 2 Tage, bis blau gefärbt). 466. Vonwiller (15, 18) und Skraup (16, 17) fixieren Vitalfärbungen (von Protozoen) durch basische Farbstoffe wie Brillantkresylblau, Neutralrot, Methylenblau, Bismarck- ^braun, ferner Nilblau, Aurantia u. a.) mit Sublimat. Die Färbung verträgt dann sogar Einbetten in Paraffin. Karbolxylol ist zu vermeiden, Benzol oder Chloroform ist unschädhch. Auch Przemicky (97 u. 00), Golowin (02) und Colombo (03) verwandten mit Erfolg die Sublimatfixierung. Die Fixierung beruht nach Skraup wahrscheinlich auf Ent- stehung schwerlöslicher Substitutionsprodukte zwischen der NHg-Gruppe bzw. N(CH3)2-Gruppe des Farbstoffes und dem Quecksilber, während nach Vonwiller (18) auch der gefärbte Plasmateil dabei eine wichtige Rolle spielt. 467. Über Doppelfärbung mit sauren und basischen Farbstoffen vgl. u. a. neuerdings Herzfeld (17) und Steckel- macher (18). 118 Das Einschließen der Präparate. § 468—471. 468. Die von Ribbert angewandte Methode der vi- talen Karminspeicherung benutzt Kiyono (14) wie folgt: Eine kalt gesättigte Lösung von Lithiumkarbonat wird mit einem Zusatz von 5 Gewichtsprozent besten Karmins (Grübler) 10 — 15 Minuten auf dem Wasserbad gekocht. Direkt vor Gebrauch wird filtriert. Man injiziert mehrere Tage 4 — 8 ccm intravenös (subkutane oder intraperito- neale Injektion ungeeignet). Fixierung in Alkohol, Formol oder Sublimat. Paraffineinbettung. Kernfärbung mit Hämalaun. 469. Unterschied zwischen Trypanblau und Kar- min. Für intravenöse Verabreichung ist Karmin, für subku- tane Trypanblau vorzuziehen; im übrigen sind die Resultate gleich. 11. Kapitel. Das Einschließen der Präparate. 470. Zur Untersuchung und Konservierung werden die nach den vorausgehenden Methoden behandelten Prä- parate gewöhnlich noch in ein besonderes Einschlußmedium gebracht, wenn sie auch an und für sich in jeder der vor- ausgehenden Flüssigkeiten untersucht werden können. Von dem Einschlußmedium ist zu fordern, daß es die Präparate durchsichtig erhält, ohne zum mindesten für die Dauer der Untersuchung ihre Struktur und Farbe zu schädigen. Die Einschlußmedien kann man im großen ganzen in zwei Gruppen trennen, je nachdem sie mit Wasser mischbar oder unmischbar sind. Beim Einschließen in ein Medium der ersten Gruppe, zu welcher die Methoden mit Gly- zerin, Gummisirup, Lävulose und Gelatine zu rechnen sind, ist eine völHge Entfernung des Wassers aus den Präparaten unnötig. Bei Anwendung einer Methode der zweiten Gruppe dagegen muß das Präparat vor dem Einschluß auf das sorgfältigste entwässert werden; hieher zählen die Einschlußmethoden mit Harzen und Ölen. Die Wahl der Methode wird durch die Zwecke, die man bei der Herstellung des Präparates verfolgt, bestimmt. 471. Der Einschluß in Glyzerin kommt hauptsächhch dann in Betracht, wenn die Schnitte vor dem Einschluß nicht mehr mit Alkohol, Xylol od. dgl. in Berührung kom- men sollen, also z. B. bei Gefrierschnitten, welche auf Fette oder Lipoide untersucht werden sollen, bei alkohollöslichen Färbungen u. dgl. Für gewisse Untersuchungen (z. B. bei Beobachtung ungefärbter Präparate) ist auch die geringere Lichtbrechung des Glyzerins (nD = 1,456) von Wert. § 4:12— ^n. Das Einschließen der Präparate. 119 Nachteilig ist, daß sich sehr viele Färbungen, insbesondere die Hämatoxylinfärbungen, in ihm nur schlecht halten. 472. Zum Einschluß breitet man das im Wasser liegende Präparat auf dem Objektträger sorgfältig aus, saugt das über- schüssige Wasser mit Filtrierpapier ab, ohne das Präparat selbst zu berühren, bringt einen Tropfen Glyzerin darauf und legt unter Vermeidung von Luftblasen ein Deckglas auf. Soll das Präparat aufgehoben werden, so muß es umrandet wer- den (s. § 478). 473. Zu beachten ist, daß Glyzerin aus der Luft Wasser anzieht. Sehr zarte Präparate deckt man mit einer Mischung von 1 Teil Glyzerin und 1 Teil 80% -Alkohol (oder Wasser) ein und legt das Präparat zur allmählichen Entfernung des Wassers vor dem Umranden in einen mit Chlorkalzium, be- schickten Exsikkator. 474. (jlyzeringelatine. Herstellung: Man weicht 7 g feinste Gelatine 2 Stunden lang in 42 ccm Aqua dest. ein, setzt 50 g Glyzerin und 1 g konz. Karbolsäure zu, erwärmt unter Umrühren 10 — 15 Minuten, filtriert heiß durch an- gefeuchtete Glaswolle oder im Heißwassertrichter und läßt erkalten. Zum Einschließen bringt man von der erstarrten Masse ein kleines Stückchen auf einem Deckglas durch vorsichtiges Erwärmen zum Schmelzen, dreht rasch um und legt den hängenden Tropfen auf das Präparat, wo sich die Masse rasch ausbreitet und erstarrt. Man kann auch das Röhrchen mit Glyzeringelatine in warmes Wasser stellen, einen Tropfen der verflüssigten Masse mit einem Glasstäbchen auf das Prä- parat bringen und rasch ein Deckglas auflegen. — Auch in Glyzeringelatine ist die Haltbarkeit der meisten Färbungen schlecht. 475. Statt Glyzerin wird auch eine gesättigte wässe- rige Lösung von Kalium aceticum gebraucht, welche die Anilinfarben meist weniger angreift wie Glyzerin. 0. Schnitze (07) empfiehlt eine Mischung von Kalium ace- ticum, Methylalkohol und Wasser aa. (nD = 1,370). 476. Für spezielle Zwecke, z. B. Amyloidfärbung, wird aus Wasser in Lävulose eingeschlossen. Man rührt 30 g Fruchtzucker mit 20 ccm Wasser an und läßt ihn 24 Stun- den bei S?** C stehen. Die Lösung muß ganz dick sein. Der Sirup, der allmähhch ganz fest wird, greift Anilin- und Kar- minfärbungen nicht an. Hämatoxyhn-Färbungen werden da- gegen nach einiger Zeit zerstört. 477. Apathys Gummisyrup wird auf dem Wasserbad aus 50 g reinem Gummi arabicum, 50 g Rohrzucker, 50 ccm Aqua dest. und 1 ccm Formol hergestellt. Die rasch erhär- tende Einschlußmasse ist stark sauer (cave für Hämatox,- Präparate), 120 Das Einschließen der Präparate. § 478 — 484. 478. Umranden. Präparate, die in flüssigen Medien eingeschlossen werden, müssen umrandet werden. Vor- bedingung dafür ist, daß die Einschlußflüssigkeit nicht über den Rand des Deckglases vordringt. Ist dies doch ge- schehen, dann muß die Verunreinigung vorher mit Fil- trierpapier und etwas abs. Alkohol vorsichtig entfernt werden oder man streut auf die benetzten Stellen etwas Bleiglätte, die sich mit dem Glyzerin zu einem Kitt ver- bindet, der dann mit dem Messer entfernt werden kann. 479. Zum Umranden nimmt man am besten eine sirupdicke Lösung von Kanadabalsam in Terpentinöl, die man mit einem Glasstäbchen dem Deckglasrand entlang aufträgt. 480. Viel gebraucht sind auch dünne Wachskerzchen. Man zündet sie an, löscht sie gleich wieder aus, fixiert das Deckglas an zwei gegenüberliegenden Ecken mit zwei kleinen Wachströpfchen und streicht nun mit dem Docht, an dem das geschmolzene Wachs herunterläuft, rasch an den Kanten des Deckglases entlang, indem man diese und die anschhe- ßenden Objektträgerteile mit einem etwa 0,5 cm breiten Streifen bedeckt. Später wird der Wachsrahmen noch ge- firnißt (§ 483). 481. Apathy empfiehlt zum Umranden eine Mischung . von trockenem Kanadabalsam und Paraffin (60'' Schmelz- punkt). Gleiche Teile dieser Substanzen werden in einer Porzellanschale zum Schmelzen gebracht und gemischt. Einen Tropfen der geschmolzenen Substanz führt man mit einem erwärmten Glasstab an den Seiten des Deckglases entlang. 482. Auch der Krönig-sche Lack (86) ist eine gute Um- randungsmasse. Anfertigung: 2 Teile Wachs werden ge- schmolzen, hiezu stückweise 7 — 9 Teile Kolophonium unter Umrühren zugesetzt (Vorsicht, feuergefährhch!). Man kann durch Gaze heiß filtrieren. 483. Es empfiehlt sich, die Umrandungen noch zu firnissen. Man benutzt dazu am besten einen Bernsteinlack oder den bei Grübler käuflichen Asphalt- oder Maskenlack, doch bekommen die beiden letztgenannten leicht Sprünge. 484. Einschluß in Gelatine. Um die Deckgläser und den Kanadabalsam durch etwas Billigeres zu ersetzen, bringt Edinger (13) die einzudeckenden Schnitte aus Wasser für 1 Stunde in eine 10% - Lösung von feinster photographischer Gelatine (Deutsche Gelatinefabrik Höchst), der 2% Glyzerin zugesetzt sind. Sodann kommen sie auf den Objektträger, auf dem ein Überguß mit der gleichen Gelatine vorher etwas erstarrt ist; hier werden sie noch- mal3 mit Gelatine übergössen. Alle diese Prozeduren werden §485—489. Das Einschließen der Präparate. 121 auf einem Tellerwärmer bei etwa 40^ C vorgenommen. Die fertigen, zunächst noch undurchsichtigen Schnitte läßt man abkühlen, taucht sie dann für eine halbe Stunde in 10% ige Formollösung, wodurch der Leim in Wasser unlöslich wird, und läßt sie trocknen, wobei die Schnitte genau so durch- sichtig wie in Kanadabalsam werden. Die Deckschicht ist steinhart und so dünn, daß auch Anwendung von Ölimmer- sionen möglich ist. Das Verfahren eignet sich für Mark- scheidenfärbung (Marchi-Präparate), Silberfibrillen, Kar- min-, Hämatoxylin- und Sudanfärbungen, dagegen ist es für alle wasserlöslichen Anilinfärbungen unbrauchbar. Die Gelatinelösung (nicht über 45^ C erhitzen!) muß jedesmal neu bereitet werden, weil mehrmals erhitzte in eine andere Modifikation übergeht, die zum Springen neigt. 485. Am gebräuchlichsten ist der Einschluß in Harze, z. B. in Kanadabalsam, welche zunächst in Lösung auf den Schnitt gebracht werden und dann fest werden. Vor- bedingung für diesen Einschluß ist vollkommene Entwässerung des Präparates. Zu beachten ist das hohe Lichtbrechungsvermögen der Harze, wodurch un- gefärbte Gewebsstrukturen oft beinahe unsichtbar werden. 486. Anfertigung des Kanadabalsams: Zu einigen Stücken des neutralen Kanadabalsams von Grübler oder des zur Glashäi^te getrockneten reinsten Kanadabalsams von Merck setzt man soviel ganz reines Xylol, daß man eine Flüssigkeit von der Konsistenz eines dünnflüssigen Honigs bekommt. Der gewöhnliche Kanadabalsam ist wegen seiner sauren Reaktion für viele Färbungen schädhch. 487. Um Kanadabalsam zu neutralisieren, gibt man in eine dünnflüssige Lösung desselben etwas Kaliumkarbonat und erhitzt auf dem Sandbad so lange, bis er beim Erkalten eine glasharte, spröde Masse bildet. 488. Als Balsamflaschen benützt man weithalsige Fla- '- sehen mit übergreifender aufgeschliffener Kappe, deren Schhff mit etwas Glyzerin eingerieben wird. Im Innern steht ein dünnes Glasstäbchen, mit dem der Balsam in Tropfen ent- nommen wird. 489. Einschluß in Kanadabalsam. Man nimmt den vorher sorgfältig entwässerten Schnitt auf einem Objekt- träger aus reinem Xylol oder Toluol, läßt abtropfen (aus- trocknen ist peinlichst zu vermeiden), bringt rasch einen Tropfen Kanadabalsam darauf und legt unter Vermeidung größerer Luftblasen das Deckglas auf. Man hüte sich, den Objektträger dabei anzuhauchen, da hierbei sich nieder- schlagendes Wasser störende Trübungen gibt. Im Laufe 122 Das Einschließen der Präparate. § 490 — 494. der Zeit verdunstet das Xylol und der Balsam wird fest. Sollte dabei der Balsam nach einigen Wochen den Raum unter dem Deckglas nicht mehr völlig ausfüllen, so setzt man an den betreffenden Rand des Deckglases einen Tropfen Kanadabalsam, der dann, allenfalls unter leichtem Er- wärmen, in die Lücke eindringt. Zum Ausgleichen von Falten, und um die Balsamschicht möglichst dünn zu be- kommen, setzt man auf das Deckglas für einige Stunden ein kleines Bleigewicht. Zur Beschleunigung des Trocknens kann man die eingedeckten Präparate für einige Tage in den Thermostaten (bei ca. 37^ C) legen. 490. Salkind (13) löst 1 g Dammarharz in 10 g Zedernöl und filtriert durch Seide. In diesem Einschlußmedium sollen sich auch sehr empfindliche AniHnfärbungen jahrelang halten. 491. Für Färbungen, die sich in Kanadabalsam nicht erhalten lassen, ist häufig der Einschluß in Terpineol (P. Mayer) empfehlenswert. Dasselbe greift mit wenigen Aus- nahmen auch zarte Färbungen nicht an und ist etwas weniger lichtbrechend (nD = 1,483). Hernach Umrandung mit Gummisirup oder besser mit 15%iger Gelatine, worauf man zur Härtung 1 Stunde lang Formoldämpfe einwirken läßt. Ebenso ist Zedernöl oft sehr geeignet, z. B. bei Os- mierungen, die sich in Xylol usw. lösen). Auch Benzyl- alkohol läßt sich verwenden (s. § 199). 492. In Euparal (nD = 1,483), das viele Färbungen gut erhält, können die Präparate schon aus 80%igem Alkohol gebracht werden (P. Mayer). 493. Für osmierte Präparate, deren Schwärzung er- halten bleiben soll, eignet sich besonders Paraffinum liqui- dum (nD = 1,482), in das die Präparate aus Xylol, Toluol oder Terpineol übertragen werden. Hierauf Umrandung nach § 479 oder 491. 494. Methode von Spalteholz (11) zum Aufhellen größerer Präparate. Die betreffenden Objekte werden in Formol od. dgl. fixiert, sodann gut ausgewaschen, ev. mit HgOg gebleicht, in steigendem Alkohol völlig entwässert und in Benzol über- tragen. Nach 2 — 3 maligem Wechseln kommen sie in die Auf- hellungsflüssigkeit, die in ihrer Zusammensetzung je nach dem Objekt etwas wechselt. Für erwachsene menschliche Knochen nimmt man 5 Gew.-Teile Wintergrünöl und 3 Benzylbenzoat oder 3 Wintergrünöl und 1 Isosafrol; für größere menschliche Embryonen 2 W : 1 B bzw. 18 W : 5 I; für jüngere 3 W : 1 B bzw. 27 W : 5 I; für jüngste 5 W : 1 B bzw. 9 W : 1 I. — Das Verfahren bietet auch für sehr dicke Schnitte, z. B. injizierte Präparate Vorteile. Nachdem die Präparate in die Endflüssigkeit, in der sie auch eingeschlossen werden, § 495 — 497. Rekonstruktionsmethoden. 123 eingetragen sind, müssen unter der Luftpumpe die in ihnen enthaltenen Benzol- und Luftreste sorgfältig evakuiert wer- den. — Blutgefäße werden häufig vorher mit gefärbten Massen injiziert (s. auch §840f, s. ferner §882). 495. Zur Konservierung anatomischer Präparate in ihrer Eigenfarbe sind besonders die Gemische von Kaiserling oder Jores zu empfehlen. Methode von Kaiserling: Fixation in Formalin 200 ccm; Wasser 1000 ccm; Kalium nitric. 15 g; Kai. acetic. 30 g. Nach 1 bis mehreren Tagen behandelt man ohne Auswaschen in 80°oig^iTi Alkohol, bis die Blutfarbe wiederhergestellt ist. Dann überträgt man in ein Gemisch von Wasser 2000 ccm; Kahum acetic. 200 g; Glyzerin 400 ccm. 496. Jores (13) fixiert 1 bis mehrere Tage in: künsthchem Karlsbadersalz 50 g, Formol 50 ccm; konz. wässer. Chloral- hydratlösung 50 ccm; Wasser 1000 ccm. Nach 6 — 24 stündigem Auswaschen kommen die Stücke in Kahum acetic. 300 g, Glyzerin 600 ccm, Wasser 1000 ccm. 12. Kapitel. Rekonstruktionsmethoden von G. Born, Breslau mit Ergänzungen vom Herausgeber. 497. Eine körperliche Anschauung der zelligen Elementarteile läßt sich meist leicht aus einem und demselben Schnitte durch sukzessives Einstellen der aufeinanderfolgenden optischen Durchschnittsebenen ge- winnen; wo dies wegen der ungewöhnlichen Form oder Ausdehnung der Elementarteile Schwierigkeiten macht (Purkinjesche Zellen der Kleinhirnrinde), da hilft die Kom- bination von Bildern, die mehreren, verschieden orientierten Schnitten entnommen sind. Schwieriger wird das Gewinnen körperlicher (drei- dimensionaler) Anschauungen mitunter schon bei den sich zunächst aus Zellen aufbauenden Organulis; — wurden doch die Endteile vieler Drüsen nach den einzelnen Schnitt- bildern bis vor kurzem fälschlich als »azinös« (beerenförmig) bezeichnet, während es in Wirklichkeit alveoli, — längere, aber mannigfach hin- und hergebogene und ausgebauchte Schläuche sind. In vielen solchen Fällen führt die Be- nutzung stark aufgehellter Dickschnitte und der bei der älteren Histologenschule vielbeliebten spezifischen Maze- rationsmittel (Holzessig, Salzsäure, starke Alkalien u. dgl. mehr) zum Ziele; gewisse Objekte dieser Art hat man jedoch aus den Schnitten rekonstruieren müssen (körperUche Form der Schilddrüsenfollikel nach J. Streif f u. dgl.). 124 Rekonstruktionsmethoden. § 498 — 499. Es bleibt aber noch eine große Zahl von anatomi- schen und namentlich von embryologischen Objekten übrig, die einerseits zu klein und von zu komplizierter Form sind, als daß sich von ihnen durch Präparation und direkte Be- trachtung mit der Lupe oder mit schwachen Mikroskop- vergrößerungen eine ausreichende körperliche (plastische) Vorstellung erwerben ließe, die aber anderseits viel zu groß und wieder zu kompliziert sind, als daß aus einzelnen Schnitten oder aus Mazerationspräparaten ihre Form (na- mentlich auch die der Binnenräume) richtig erschlossen werden könnte. In diesen Fällen ist man gezwungen, eine Rekonstruktion solcher Gebilde aus den Bildern, die die aufeinanderfolgenden Schnitte einer Serie gewähren, aus- zuführen. 498. Die Rekonstruktion kann entweder eine flächen- hafte (rein zeichnerische) sein, bei der die Tiefendimension nur durch Verkürzung und Schattierung in der Fläche einigermaßen dargestellt wird, oder sie ist eine körperliche — plastische. In beiden Fällen wird die Rekonstruktion wohl immer mit einer mehr oder weniger erheblichen Ver- größerung verbunden sein. Wie leicht verständlich, er- scheint die zeichnerische Rekonstruktion häufig nur als ein provisorisches Hilfsmittel und muß auf leichtere Fälle beschränkt werden. Alle Rekonstruktionsmethoden sind mühsam und zeit- raubend; man vermeide sie also, wenn man mit anderen Hilfsmitteln, mit Präparation, Mazeration, Injektion, Korro- sion usw. auskommt; anderseits kann nicht genug davor gewarnt werden, sich auf die vielfach beliebte »Rekon- struktion im Kopfe« (aus den Schnittbildern) bei irgend- welchen schwierigen Objekten zu verlassen. Außerdem liefern namentlich die plastischen Rekonstruktionen ver- größerte und darum leichter demonstrable Präparate. 499. Die Voraussetzung jeder Rekonstruktion ist die Herstellung einer lückenlosen Serie von paral- lelen Schnitten durch das Objekt, — eine Forderung, die (mit Ausnahme einiger besonderer Konstruktionen) mit allen modernen Mikrotomen leicht zu erfüllen ist. Meist wird die Serie gleichmäßig dick sein; — doch kann es sich in besonderen Fällen empfehlen, zwischen dickere Schnitte in bestimmten Abständen einen halb so dünnen einzu- schalten. Unter allen Umständen muß die Schnittdicke bestimmt und bekannt sein; man wähle je nach der Größe und Schneidbarkeit des Objekts Schnitt dicken von §500. Rekonstruktionsmethoden. 125 6, 8, 10, 12, 15, 20 ju. Die Schnittrichtung ist zwar theoretisch beUebig, in praxi aber ist meist eine zu der Hauptachse des Objekts parallele oder senkrechte Richtung zu bevorzugen. Stückfäi'bung ist der Schnittfärbung durchaus vor- zuziehen; ebenso Paraffin- oder Zelloidineinbettung. Noch besser ist Einbettung in Zelloidin-Paraffin nach § 238, da bei ihr Verschiebungen und Faltungen besser ver- mieden werden als bei Paraffineinbettung. Als ideale Me- thode für Rekonstruktionsserien bezeichnet Apathy die Einbettung in Ölgelatine (nach § 239). Unter allen Um- ständen müssen die Schnitte in richtiger Aufeinander- folge ganz glatt — ohne irgendwelche Verschiebung (auch von ringsum isolierten Teilen!), ohne Verzerrung und Faltenbildung auf den Objektträger aufgelegt und aufge- klebt werden. Die hierfür gebräuchlichen und empfehlens- werten Verfahren siehe § 503 und § 1442. Die Zuverlässigkeit und Schönheit jeder Rekonstruk- tion hängt durchaus von der Vollkommenheit der Schnitt- serie ab; man verschwende keine Mühe und Zeit mit Rekonstruktionsversuchen aus lückenhaften, ungleichen und schlecht aufgelegten Serien! 500. Methoden von Rekonstruktionen in der Fläche: 1. Die Herstellung eines Bildes, dessen Fläche senkrecht zur Schnittebene der Serie liegt (pro- jektive Konstruktion nach His, das älteste und auch jetzt noch vielfach und mit Erfolg benützte Verfahren). Beispielsweise Aufgabe: Es sei das Bild der Organe eines kleinen menschhchen Embryos im Medianschnitte nach einer gleichmäßigen Querschnittserie von 20 « Dicke in 60- facher Vergrößerung herzustellen. — Lösung: Von dem in Zedernholzöl (od. dgl.) aufgehellten, im Stück gefärbten Em- bryo werden möglichst vielseitige Zeichnungen bei bestimmter (5- oder lOfacher) Vergrößerung abgenommen; für unser Bei- spiel ist eine genaue Profilzeichnung notwendig. (Die Zeich- nungen sind womöglich, während der Embryo im flüssigen Paraffin liegt, zu wiederholen.) Jeder Schnitt der 20 /n dicken Querschnittserie ist bei 50facher Vergrößerung zu zeichnen, um diesen Zeichnungen die nötigen Maße direkt entnehmen zu können. Arbeitet man a) ohne Richtebene (siehe § 508), so muß die Schnittrichtung genau bekannt sein, — oder dieselbe muß durch Vergleich der Lage bestimmter Punkte in den Schnitten und fm Profil- bilde aufgesucht und in dieses eingetragen werden. Arbeitet man b) mit Richtebene, so ist die genaue Fixierung der Schnittrichtung entbehrlich. 126 Rekonstruktionsmethoden. § 500. Ad a). Eine Pause der auf 50 mal gebrachten Profil- zeichnung wird so auf »MilUmeterpapier« geklebt, daß die Querlinien des Papiers der bekannten oder nachträglich be- stimmten Schnittrichtung genau parallel laufen; nun nume- riert man die Querlinien vom Kopfende an, entsprechend den Schnittnummern und trägt auf jeder Linie die Abstände, die die Organe auf der 50 fach vergrößerten Zeichnung des zugehörigen Schnittes in der Medianlinie vom Umriß der Profilzeichnung und voneinander zeigen, ab. Die Verbin- dung der entsprechenden Punkte gibt dann den Umriß der betreffenden Organe im Medianschnitte. Ad b). Die Medianlinie jedes 50 mal vergrößerten Schnittbildes wird so weit verlängert, bis sie die mitgezeich- nete Richthnie schneidet. Die Medianschnittpunkte der Richthnien werden in der Reihenfolge der Schnitte auf einer Senkrechten des Millimeterpapiers markiert und numeriert. Die Abstände, welche die Umrißlinien und die Organe in der Medianlinie auf den 50 mal vergrößerten Zeichnungen von diesen Punkten zeigen, werden an den zugehörigen Hori- zontalen des Millimeterpapiers abgetragen und die entspre- chenden Punkte der aufeinanderfolgenden Linien miteinander verbunden. Bei diesem Verfahren entsteht der Umriß des ganzen Embryos erst nachträglich, zugleich mit den Um- rissen der Organe bei der Konstruktion des Medianschnittes. Es ist klar, daß sich nach dieser Methode auch laterale Teile, auf die Medianebene projiziert, darstellen lassen, so daß man z. B. nicht nur den Umriß, sondern auch annähernd das abschattierte Tiefenbild der median durchschnittenen Organe herstellen kann. In gleicher Weise lassen sich auch Lateralansichten, Frontalschnitte, Frontalaufsichten usw. aus einer Querschnittserie gewinnen. Nach einer solchen zeichnerischen »Durcharbeitung« einer Serie in den verschiedensten Schnitten und Aufsichten ging His daran, das betreffende Objekt (oder bestimmte Organe desselben), unter stetiger Berücksichtigung der den Schnitt- bildern entnommenen Maße, »frei« zu modellieren — ein Verfahren, das trotz ausgezeichneter Resultate in den Händen seines Autors wegen der hohen Anforderungen, die es bei mannigfachen subjektiven Fehlerquellen an das künstlerisch- technische Geschick des Arbeiters stellt, kaum Nachahmung gefunden hat. 2. Die „graphische Isolierung" nach Kastschenko (86, 87, 88; siehe in Zeitschr. f. wiss. Mikr. 87, p. 355 auch die Vorläufer). Vorausgesetzt ist, daß das Objekt im Paraffin von ihm dicht anliegenden, sich winklig schnei- denden und zur Schnittebene senkrechten „Definierflächen" umgeben ist, oder daß sich neben demselben eine »Richt- fläche mit Richtleisten« (siehe § 502) befindet. § 501—502. Rekonstruktionsmethoden. 127 Die vergrößerten Schnittbilder der »graphisch zu isolieren- den Organe« werden der Reihenfolge nach übereinander auf Karton gezeichnet, wobei aber dafür gesorgt wird, daß sich jedesmal die Durchschnittshnien der Definierflächen, resp. die gezackten Richtlinien, genau decken. So entsteht ein richtig orientiertes System um- und nebeneinander gelagerter Umrißlinien, nach denen sich die Aufsicht auf das Organ senkrecht zur Schnittebene leicht entsprechend schattiert her- stellen läßt. 501. Für plastische Rekonstruktionen wird jetzt all- gemein die Plattenmodelliermethode (Born) benutzt: — Ihr Prinzip ist folgendes: Aus jedem Schnitt einer gleichmäßigen Serie werden die Teile, die man plastisch rekonstruieren will, in einer bestimmten Vergrößerung auf Platten aufgezeichnet, die ebensovielmal dicker als die Schnitte der Serie sind, wie die Flächenvergrößerung beträgt. Die interessierenden Teile werden dann aus den Platten herausgeschnitten und die Ausschnitte der Reihenfolge nach aufeinander geklebt. Geschieht dies in der richtigen Weise — ohne seitliche Verschiebungen — , so muß, nachdem die Stufen zwischen den Rändern der Platten geglättet sind, ein in allen drei Dimensionen richtig vergrößertes plastisches Ab- bild des durch die Schnittserie zerlegten Objekts heraus- kommen. Nehmen wir zur Erläuterung ein ähnliches Beispiel wie oben: — Aus der gleichmäßig 20 fi dicken Querschnittserie durch einen kleinen menschlichen Embryo sei der Darmkanal 50 mal vergrößert plastisch zu rekonstruieren. — Man hat dazu die Durchschnittsfigur des Darmkanals aus jedem Schnitte in 50facher Vergrößerung auf 50 x 20 ^, d. h. 1 mm dicke Platten, aufzuzeichnen. Die richtig übereinander ge- klebten Ausschnitte der Durchschnittszeichnungen des Dar- mes aus diesen Platten ergeben die 50 mal vergrößerte, pla- — stische Rekonstruktion des Organs. In betreff der Einzelheiten des Verfahrens sei hier noch folgendes bemerkt — für Genaueres muß auf die angeführte Literatur verwiesen werden: 502. Richtfläche mit Richtleisten. Wenn man nicht nach einer fertigen Serie modellieren muß, versäume man nicht, an dem Paraffinblock dicht neben dem Objekt eine zur Schnittebene senkrechte Richtebene mit ebenso senkrechten Richtleisten anzubringen; auf den Schnitten resultiert daraus eine neben jedem Schnitte liegende, gezackte Richtlinie (über Zweck und Bedeutung der- selben siehe unten § 508). Das neue, hier wiedergegebene 128 Hekonstruktionsmethoden. § 502. Verfahren von Born und Peter (98, 99), das jetzt schon vielfach erprobt ist, schheßt sich direkt an die gewöhnHche Art, nach der man Paraffinblöcke gießt, an. Über andere, ältere, in einzelnen Fällen sogar unentbehrliche Verfahren zur Herstellung von Richtlinien siehe die angeführte Literatur. Man stellt sich eine rechteckige Kammer her, indem man zwei rechte Winkel (Neapler Rähmchen) auf einer plangeschliffenen, mit drei Füßchen versehenen Grund- platte so zusammenfügt, daß ihre unteren Ränder genau mit den (2 cm langen) Seiten eines auf der Grundplatte eingeritzten Quadrates zusammenfallen. Dieses quadra- tische Feld der Grundplatte, das den Boden der Kammer bildet, trägt in einem mittleren Streifen ein System von untereinander und zu zwei Seiten des Quadrates parallelen, dicht nebeneinander liegenden Ritzen. Am besten ist die von Zeiß-Jena aus Glas hergestellte Richtplatte nach Born- Peter (Preis 40 M.). Aus Metall kann dieselbe leicht jeder Mechaniker anfertigen (event. Kleinert, Breslau, Breite- straße). In diese rechteckige Kammer, deren Grund- platte und Seitenwände vorher sehr sorgfältig mit Alkohol und dann mit Chloroform geputzt wurden (ev. zuletzt noch mit einer Spur Alkohol- Glyzerin abgerieben), und die im ganzen auf einige 50^ C erwärmt war, wird auf etwa 70^ C erhitztes Paraffin eingegossen, — das imbibierte Objekt eingebracht und (für eine Querschnitt- serie) mit seiner Längsachse senkrecht zu der dem Arbeiter zugewandten Seitenfläche (der Fußfläche) orientiert. Bei gläserner Grundplatte benutzt man dazu bei durch- fallendem Lichte sichtbare, sich senkrecht überkreuzende, geschwärzte Linien, die auf der Unterseite des quadrati- schen Feldes eingraviert sind. Die Kammer wird außen mit kaltem Leitungswasser umgeben. Die Oberfläche des Paraffins hält man mit heißem Spatel 10 — 15 Minuten lang flüssig, während es von unten her langsam erstarrt. Man verhütet dadurch, daß das schrumpfende Paraffin die untere Fläche des Blockes mit den Richtlinien ein zieht. Nach längerem Liegen in kaltem Wasser lösen sich Winkel und Grundplatte glatt ab; — man erhält einen rechteckigen (parallelepipedischen) Paraffinblock. Die Fußfläche desselben wird auf die mit definitiv fest- gestelltem Quermesser auf dem Paraffintische des Mikrotoms angeschnittene Fläche aufgestellt und mit über- hitztem Paraffin an dieser festgeschmolzen; dann stehen § 502. Rekonstruktionsmethoden. 129 die Längsachse des Objekts, die von der Grund- platte abgelöste, mit parallelen Leisten ver- sehene Fläche des Blockes (die Richtfläche) so- wie diese Leisten selbst (die Richtleisten) senk- recht zur Schnittebene. Die Leistenfläche erhält einen dünnen Anstrich von schwarzem Lack. Peter (06) empfiehlt dazu als besten Überzug für Paraffin- wie Zelloidinblöcke einen Schuhlack englischer Herkunft »Nubian Water- proof Blacking« (bei Grübler erhältlich). Der Überzug muß ganz dünn sein. Nach Trocknen desselben schneidet man um das Objekt und von der Leistenfläche alles, was nicht notwendig ist, vorsichtig ab ; der Rest wird auf einen Augenblick in Paraffin von 75^ C getaucht und nach dem Erkalten dieses Eintauchen so oft wiederholt, bis die Leisten- fläche (Richtfläche mit Richtleisten) einen etwa einen Milli- meter dicken Paraffinüberzug trägt. Zur Zelloidineinbettung befestigt Peter (06) die Winkel auf der Grundplatte, indem er in die Spalten einen Tropfen Schellackfixativ einfließen läßt, das die Flächen rasch aneinander kittet. Das Eindicken des Zelloidins nehme man recht langsam vor. Beim Einsetzen des Appa- rates in 80% igen Alkohol löst sich das Fixativ auf, Winkel und Grundplatte fallen ab. »Man erhält einen Zelloidin- würfel mit Richtfläche und Richtleisten, der ganz dem Paraffinwürfel gleicht.« Wenn nun das Quermesser beim Schneiden der Serie nicht mehr verrückt wird, wird das Objekt in Schnitte zerlegt, die senkrecht zur Längsachse desselben stehen und welche gleichzeitig die geschwärzte ßichtfläche mit den Richtleisten senkrecht treffen. Dicht neben jedem Schnitte liegt dann eine feine, gezackte, schwarze »Richtlinie« (mit vom Schnitte abgewendeten Zacken!). — Würde man sämtliche Schnitte der Reihenfolge nach so auf- einander legen können, daß alle gezackten Richt- linien sich wieder zu einer senkrechten Richt- fläche mit senkrechten Richtleisten zusammen- fügten, so würden auch alle Organdurchschnitte richtig, d. h. ohne seitliche Verschiebung, auf- einanderfallen. — In der hier angedeuteten Weise — nur daß nicht die Schnitte, sondern deren vergrößerte Bilder aufeinandergelegt werden — werden die Richtlinien bei Flächenrekonstruktionen (§ 500) sowie bei der Platten- modelliermethode benutzt. Romeis. Taschenb. d. inikrosk. Technik. 8. Aufl. o 13Ö Rekonstruktionsmethoden. § 503—506. 503. Die Schnittserie. Die" sorgfältig hergestellten Serienschnitte klebe man nach einer der in § 272 — 282 angeführten Methoden auf, wobei man auf völüge Strek- kung der Schnitte und gleichmäßige Ordnung derselben achte. Sehr empfehlenswert ist die in § 282, 3 angegebene Methode von Apathy: Nach dem Trocknen taucht man Paraffinpräparate nach Peter (06) zuerst in abs. Alkohol, da sich sonst die Lackhnie im Xylol kräuselt. Dann folgt Xylol, und wenn die Präparate nicht im Stück durch- gefärbt sind, Nachfärbung. Ferner § 1442. 50J:. Das Zeichnen. Man zeichne mit Benutzung des Oberhäuserschen Prismas, des Abbeschen Spiegels oder am besten unter Zuhilfenahme eines Projektionsapparates, da dieser selbst bei starken Vergrößerungen (100 — 150 mal), die immer zu bevorzugen sind, ein großes und ebenes Ge- sichtsfeld gewährt. Walzt man die Platten selbst aus, so zeichne man mit Kopierstiften (um Kopien abnehmen zu können) auf ein möghchst ungeleimtes Druckpapier (Zei- tungspapier); auf fertige Platten wird mit einem weichen Bleistift gezeichnet. Man mache es sich zur Regel, eher etwas zu viel als zu wenig zu zeichnen. 505. Die Platten wurden anfänghch aus Wachs ge- gossen. Jetzt werden meist gewalzte, planparallele Wachs- papierplatten (nach Strasser-Borns Vorschriften) benutzt. Bei diesen ist eine Wachsschicht zwischen zwei Papier- blättern eingeschlossen ; das eine Blatt dient zur Aufnahme der Zeichnung (möglichst ungeleimtes Druckpapier, siehe den vorigen Paragraphen), das andere Blatt ist nur eine Decklage von Florpapier. Die Papierüberzüge verleihen den Platten und damit dem ganzen Modell einen hohen Grad von Elastizität. Solche Wachspapierplatten liefert Dr. Grübler-Leipzig in den gebräuchhchsten Dicken. Da man aber von jeder Platte nur einen kleinen Ausschnitt braucht, kommt die Benutzung der käuflichen Platten ziem- lich teuer zu stehen; es ist daher dringend anzuraten, die Wachspapierplatten nach den bei Peter (08) gegebenen Vorschriften selbst herzustellen. 506. Peter benutzt reines gelbes Bienenwachs. Da dieses sehr teuer ist, benutze ich folgende Mischung: Gelbes Bienen - wachs 1 Gew.-Teil, Paraffin (Schmelzp. 40-45») l Gew.-Teil, Paraffin (Schmelzp. 50 — 52'^) 1 Gew.-Teü. Fedorow empfiehlt Zeresin (Ceresin. flav. U. O.) oder Mischung desselben mit Wachs. Ebenso Kappers (15) Zeresin (Schmelzp. 55 — 58») 2 Teile; Wachs 1 Teil. § 507 — 509. Rekonstruktionsmethoden. 131 507. Neuere vollkommenere Instrumente zum Platten- walzen sind z. B. der von Berner (10) beschriebene Jungsche Apparat, sowie die von L. Neumayer (11) beschriebene elek- trisch heizbare Walze nebst Walzfläche mit verstellbaren Gleitschienen. 508. Das Ausschneiden und das Aufeinanderpassen der Ausschnitte. Zum Ausschneiden werden am besten ganz kurze, schmale und spitze Messerchen (abgeschliffene Skalpelle) benutzt. Sehr zweckmäßig sind dazu die Be- schneidefedern, wie sie zum Beschneiden von Photographien gebräuchlich sind. Man beginne mit den Hohlräumen und lasse zwischen allen, gar nicht oder nur schmal zusam- menhängenden Teilen provisorische Verbindungsstreifen (»Brücken«) stehen, die später — wenn die vorher getrennten Teile sich beim Aufeinanderpassen vereinigt haben — ent- fernt werden; bleiben Modellstücke dauernd isoliert, so werden die »Brücken« zuletzt durch Drahtstifte u. dgl. ersetzt. An der »Richtlinie« bleibt ein fingerbreiter Wachsstreifen stehen, aus dem die Richtzacken heraus- stehen; natürlich wird dieselbe auch mit den Schnitten durch »Brücken« verbunden. Muß *'man ohne »Richtlinien« modellieren, so braucht man doch keine allzugroßen Fehler zu befürchten : »Die Profilkontur, durchgehende gestreckte Gebilde, wie Chorda, Blutgefäße usw., schützen meist vor falschen seitlichen Ver- schiebungen bei dem Aufeinanderpassen der Ausschnitte; außerdem besitzen die Schnitte durch ein einigermaßen kompliziertes Gebilde so viele Merkmale zweiter und dritter Ordnung, die immer nur eine bestimmte Art der Aufeinander- passung möglich oder wahrscheinlich machen, daß ein Ab- irren nicht leicht vorkommen kann.« Besser und sicherer aber ist es, eine »Richtlinie« neben jedem Schnitte zu haben. Man braucht dann nur die die Richtlinien tragenden Wachsstreifen so aufeinander zu passen, daß die Richtlinien mit ihren Zacken senkrecht über- einander fallen, damit alle Ausschnitte des Objekts richtig — ohne seitliche Verschiebungen — aufeinander zu liegen kommen (siehe den Schluß von § 502). Weitere Bemer- kungen bei Lebedkin (14). 509. Die Vollendung des Modells. Man lege zuerst etwa 5 Ausschnitte richtig übereinander und befestige die- selben provisorisch, indem man ihre breiteren Teile mit einem stark erhitzten, schmalen Modellierspatel durchsticht; dann glättet man die Stufen und verschmilzt die Ränder mit dem heißen, breiten Spatel. Darauf werden wieder 5 — 6 Ausschnitte aufgelegt usw. Man glaube nicht, wie 9* 132 Rekonstruktionsmethoden. § 509 a. dies manche tun, daß ein Modellstück mit ungeglätteten Stufen »naturwahrer« sei als ein ausgeglättetes. Im Interesse des Einblicks in Hohlräume usf. wird man das Modell häufig nicht in einem zusammenhängenden Stücke fertigstellen, sondern dasselbe heber nach provisorischer Ver- einigung und oberflächlicher Glättung in bestimmten Ebenen wieder in getrennte Stücke zerlegen, Schaper (04) benutzt zum Zerschneiden großer Modelle einen durch elektrischen Strom glühend gemachten Draht. In anderen Fällen schneidet man »Fenster« ein, setzt »Stütz- und Verbindungsdrähte« an und was dgl. mehr ist. Über die rechtzeitige Entfernung der Brücken siehe oben. Zuletzt glättet man mit dem heißen Spatel, mit einem breiten, in Terpentin getauchten Pinsel, mit der Finger- beere usf., so weit wie möglich; ein glattes Modell, an dem die zufälligen Unebenheiten entfernt sind, läßt die charakteristischen Formen viel besser erkennen als ein rauhes. L. Neumayer (07) trägt auf die Oberfläche des zuerst mit Alkohol abgewaschenen und dann mit einer dünnen Schellack- lösung bestrichenen Wachsmodells zur Konsolidierung er- wärmten Knochenleim auf und bemalt es dann mit Ölfarben. Emaillack (Blundells Petrifying Liquid, Spence and Co., Li- mited in Hüll) an Stelle des Leims mehrmals aufgetragen macht wasserbeständig. Weitere Angaben siehe bei Peter (06) und Röthig (04). 509a. Statt Wachsplatten wurden verschiedentlich auch andere Materiahen wie Pappe, Blech usw. benutzt. Am besten unter diesen Methoden ist das Verfahren von Triepel (18), der die Zeichnung auf dünne Elfenbeinkartons (0,4 mm) auf- klebt und dann ausschneidet. Um die entsprechende Schnitt- dicke zu bekommen, klebt man dann noch kleine Papp- stückchen dazwischen. Zuletzt gießt man die Spalten mit Wachs aus. Die Dicke der Materialien ergibt sich aus der Formel: Zeichenpapier x Karton + Pappscheibchen = Vergröße- rung X Schnittdicke. Näheres im Original. W^'^'. Spezieller Teil. 13. Kapitel. Die Untersuchung der Zelle und ihrer Bestandteile. A. Untersuchung des Zellkerns. BIO. Material. Als Untersuchungsobjekte eignen sich wegen ihrer bedeutenden Zellgröße besonders Amphibien, namenthch Larven von Fröschen und Tritonen. Noch gün- stiger, aber schwieriger zu bekommen sind junge Entwick- lungsstadien von Salamandra mac. und atra, sowie von Axolotl. Von höheren Wirbeltieren bieten u. a. Meerschwein- chen vorteilhafte Verhältnisse. Auch zahlreiche Wirbellose, z. B. Eier des Spulwurms, Spinndrüsenzellen von Raupen, Speicheldrüsenzellen von Chironomuslarven usw. sind gün- stige Objekte. 511. Für Beobachtungen und Versuche an lebenden Zellkernen empfiehlt Groß (16) Zellen des Schwanzflossen- epithels von Salamander- bzw. Tritonenlarven, der Speichel- drüsen von Limnaea stagnahs, der Malpighischen Gefäße von Corethra und ferner Eizellen von Unio und Anodonta. Sehr schöne zytologische Untersuchungen lassen sich auch an den lebenden Zellen von Gewebekulturen (vgl. Kap. 3) anstellen. 512. Reaktionen am frischen Präparat. Groß (16) unter- scheidet im lebenden Zellkern zwischen Oxychromiolen (nicht immer vorhanden), Chromatinkörnchen und Netz- knoten. Die Netzknoten werden durch konz. HCl, 5%iges NHg und 10% ige NagCOg zum Teil oder vollständig gelöst, während die Chromatinkörnchen weniger und die Oxychro- miden nicht (außer von HCl) angegriffen werden. Die Kern- membran wird in konz. HCl etwa in 1 Stunde, in 5%iger NHg nach ca. 30 Minuten, in 10%iger NagCOg in etwa drei Stunden gelöst. Die Nukleolen werden durch konz. HCl gelöst; in 5%iger NHg tritt zuerst Quellung und dann Lösung ein. In 10%igem NagCOg tritt ebenfalls Quellung und Lösung ein, wobei vom chromatischen Teil noch ein Rest zurück- bleibt, ebenso in 10%igem NaCl. Diese Reaktionen treten nur bei Verwendung frischen, nicht konservierten Materials ein. 134 Die Untersuchung der Zelle. § 513—519. 518. Sehr instruktive Präparate erhält man, wenn man etwas frisches Gewebe in einem Tropfen einer Lösung von Methylgrün in 0,75'^oiger Essigsäure zerzupft. Dann läßt man 15 Minuten Osmiumdämpfe einwirken und untersucht in Glyzerin oder in dem Gemisch von Ripart und Petit (Eis- essig 1 ccm; Kupferazetat 0,3 g; Kupferchlorid 0,3 g; Kamp- fer- oder Thymolwasser 75 ccm; dest. Wasser 75 ccm). 514. Verhalten der Kerne gegenüber Verdauungsflüssig- keiten. In leichtangesäuerter Pepsinlösung wird das Nuklein der Kerne nicht angegriffen. Durch Trypsin werden die Kerne dagegen gelöst. Zum spezif. Nachweis von Nukleinsäurever- bindungen läßt van Herwerden (13, 14) auf alkoholfixierte Präparate 24 — 48 Stunden bei 37° C Nuklease einwirken, wodurch in zahlreichen Fällen die nukleinsauren Verbindungen in Lösung gehen. Die Nuklease gewinnt man durch Sättigung von Milzpreßsaft mit Ammoniumsulfat; die Fällung wird ge- trocknet und vor Gebrauch zur Entfernung des Ammonsul- fats 24 Stunden dialvsiert. Der Schlauchinhalt enthält das wirksame Enzym. 515. Zur Fixierung von Mitosen usw. (frisches Mate- rial!) eignen sich insbesonders für Anfänger, für Übersichts- bilder und Kurszwecke hauptsächlich rasch eindringende Lösungen, z. B. Sublimat-Eisessig (§ 183), Subtrie (§ 182), Sublimat-Trichloressigsäure-Formol (§ 184), oder die Flüs- sigkeiten von Bouin (§ 163), Carnoy (§ 118). Hierauf Schnitt- oder Stückfärbung mit einem AlaunhämatoxyHn {§ 344, 351 oder 353) oder Karmin (§ 334) oder Schnitt- färbung mit Safranin oder anderen basischen Anilinfarb- stoffen. 516. Für Untersuchungen der Chromophilie des Kernes (Basichromatin-Oxychromatin) ist besonders Fixierung in abs. Alkohol von Bedeutung und Färbung mit Methyl- grün-Pyronin und M.-P. -Orange [vgl. § 434, 435 und Pappen- heim (08)]. 517. Nach Hammer (91) laufen die Mitosen beim Men- schen nach dem Tode nicht ab, sondern gehen durch Chroma- tolyse zugrunde. Die achromatische Spindel erhält sich lange. Ähnhch Schenk (90). 518. Für genauere Untersuchungen des Kernes (wie auch anderer Zellstrukturen) ist es nicht nur unerläßlich, daß das Material frisch fixiert wird, sondern dasselbe muß auch von völlig gesunden, unter normalen Lebens- bedingungen stehenden (frisch gefangenen) Tieren stammen. (Über den Einfluß ungünstiger äußerer Lebens- bedingungen auf die Kernstruktur der Eizellen vgl. Stieve 13, 18.) § 519—525. Die Untersuchung der Zelle. 135 619. Als feinere Untersuchungsmethoden seien beson- ders folgende hervorgehoben: a) Fixierung mit Flemmingscher Lösung § 125. Schnitt- färbung mit Safranin § 392 ff., Safranin-Lichtgrün § 523, nach M. Heidenhain § 358 f., nach § 528, u. a. b) Fixierung mit Platinchlorid nach § 170 oder 171, Falben mit Delafieldschem oder Ehrlichschem Alaunhäma- toxylin (§ 351 oder 353). Untersuchen ev. schon in Wasser oder Methylalkohol. c) Fixierung nach Hermann (§ 158 ff.). Färbung der Schnitte mit Safranin (§392ff.), Safranin- Gramscher Farbe (§ 1254), nachM. Heidenhain (§358 f.). Auch ohne Färbung sind, insbesondere nach Holzessigbehandlung (§ 160), viele Strukturen zu sehen. Mit diesen drei Methoden fixiere man nur ganz kleine Organstückchen (1 — 3 cmm). Größere und schwer durch- dringbare Objekte fixiere man besser wie folgt: d) Fixierung mit Sublimat-Eisessig, § 183, oder nach Bouin § 163, Färbung mit Ehrlichschem Alaunhämatoxylin (§ 353), Methylgrün-Pyronin (§ 434), nach M. Heidenhain (§ 358f.), nach Obst (§ 521), ^Triacid (§ 436) u.a. 520. Die osmiumsäurehaltigen, nur schwach angesäuerten Fixierungsflüssigkeiten scheinen Kern- und Zellstrukturen am ebensähnlichsten zu erhalten (vgl. Lewitzky, Lewis 15). 521. Obst schließt an Sublimatfixation eine 16 — 17- stündige Stückfärbung mit Boraxkarmin. Sodann Schnitt- färbung mit stark verdünnter wässeriger Lichtgrünfärbung. Chromatin rot, Nukleolen grün. 522. Nach Fixierung in Flemmingscher oder Hermann- scher Lösung färbt Methylgrün-Pyronin oft das Ghromatin rot und die Nukleolen grün. 523. Nach Kernfärbung mit Safranin (§ 393) emp- fiehlt sich als Kontrastfärbung oft Lichtgrün (Benda). Man "differenziert dazu die 24 Stunden in Safranin gefärbten Schnitte nach Abspülen in Wasser in einer l%igen Lösung von Lichtgrün in 96%igem Alkohol. Dann abs. Alkohol, Xylol, Balsam. 524. Besonders wertvoll für das Studium des Chromatins ist die progressive Färbung mit stark verdünntem Delafield- schen Hämatoxylin (§ 351), ev. Differenzieren in stark ver- dünnter Alaunlösung (s. § 347), ferner mit Methylgrün. 525. Ob die Färbungen mit Karmin und Hämatoxylin mit denjenigen basischer Anilinfarbstoffe vollständig über- einstimmen, ist noch nicht sichergestellt. Karmin leistet wegen seiner relativ weniger intensiven Färbung bei Unter- suchungen allerfeinster basichromatischer Strukturen weniger 136 Die Untersuchung der Zelle. § 526—528. wie intensiv färbende dunkle Farben. Doch läßt sich jetzt dieser Nachteil mit Hilfe der Quarzquecksilberlampe (vgl. § 25), bei der bei entsprechendem Filter rotgefärbte Struk- turen schwarz hervortreten, ausschalten. 526. Zur Unterscheidung der gewöhnliehen und der sauren Kerne färbt Unna (14) wie folgt: 1. Färbung der Alkohol-Zelloidinschnitte 5 Minuten in Böhmerscher Alaun- hämateinlösung (vgl. § 354). [Ich ziehe das Hämalaun von P. Mayer (§ 344) oder die Ehrlichsche Lösung (§ 353) vor.] 2. Auswaschen in Leitungswasser 10 Minuten, bis alle Kerne blau. 3. In einer l%igenSafraninlösung (Marke 0, Grübler) werden in 20 Minuten alle Kerne rot umgefärbt. 4. Ab- spülen in Leitungswasser. 5. Differenzieren in Tannin 25 g; Pikrinsäure 0,1 ; Wasser 100 cc 2 — 5 Minuten je nach Schnitt- dicke. 6. Auswaschen in Wasser 10 Minuten usw. Resultat: Gewöhnliche Kerne blauviolett, Mitosen und Keratohyahn dunkelblauviolett; Kernkörperchen und saure Kerne gelb- rot-braunrot; Fibrin, glatte Muskeln, Keratin scharlachrot. B. Centrosom und Sphäre, Protoplasma. 527. Als Material für die Untersuchung der achroma- tischen Zellbestandteile eignen sich besonders Eier von Ascar. megaloc. und Hoden von Schmetterlingsraupen (besonders Lymantria-Arten). Ferner, jedoch schwieriger zu bekommen: Eier mariner Strudelwürmer (Thysanazoon), von Rhynchelmis, von Piscicola (letztere in Fischzucht- anstalten erhältlich). 528. Zur Darstellung von Centrosom, Spindelfäden, Lininfäden und Polstrahlen eignet sich besonders die von Flemming (91 und 95) empfohlene Färbung mit Safranin- Gentianaviolett- Orange. Leider ist die Methode etwas lau- nisch, was zu zahlreichen Modifikationen Veranlassung gab. Die Hauptursache des Fehlschlagens ist ungeeignetes Sa- franin (vgl. § 392). Am besten erwies sich mir die Modifikation von Winiwarter u. Saimont (08): Fixierung nach Flemming (§ 125). Wichtig ist, nach der Fixierung 24 Stunden in fließendem Wasser gut auszuwaschen und bald in Paraffin einzubetten. Werden die Schnitte erst • nach mehreren Jahren angefertigt, so müssen sie zur Wieder- herstellung ihrer Färbbarkeit nach dem Aufkleben auf 24 Stun- den in Flemmingsche Lösung eingelegt werden. Ebenso wer- den auch aufgeklebte Paraffinschnitte von anders fixiertem Material dadurch brauchbar, daß man sie 24 Stunden in Flemmingsche Flüssigkeit stellt und 20 Minuten in fließendem Wasser auswäscht. § 529—531. Die Untersuchung der Zelle. 137 Färbung: 1. Xylol, abs. Alkohol 95% ig und 65%iger Alkohol. 2. 24 stündige Färbung in Safranin, nach § 393, mehrmahges Waschen in dest. Wasser. 3. Färbung 24 Stun- den in 1 % iger wässeriger Gentianaviolettlösung. Mehrmaliges Waschen in dest. Wasser. 4. Eintauchen in eine wässerige Lösung von Orange G, etwa 1 Minute; ihre Konzentration hängt von dem zu färbenden Objekt ab und muß empirisch durch Kontrolle unter dem Mikroskop festgestellt werden. Embryonales Material erfordert 3 — 4 mal stärkere Konzentra- tion als anderes. 5. Eintauchen in angesäuerten Alkohol (6 — 8 Tropfen einer Mischung von gleichen Teilen abs. Alko- hols und reiner Salzsäure auf 100 ccm abs. Alkohol). Beim ersten Auftreten von violetten Wolken (nach 2 — 3 Sekunden!) werden die Schnitte sofort entfernt, und 6. in reinem Alkohol ordentHch ausgewaschen, um Säure und Farbüberschuß zu entfernen. 7. Langsame Differenzierung unter dem Mikro- skop in einer Mischung von Nelkenöl und wenig abs. Alkohol, bis die Schnitte eine schöne blaue Farbe in kernreichen, eine intensiv gelbe Farbe in kernarmen Teilen aufweisen. 8. Reines Nelkenöl zur Entfernung des Alkohols. 9. Aufstellen der Objektträger, um das Öl ablaufen zu lassen. 10. Auswaschen in Xylol; Kanadabalsam. Statt Nelkenöl-Alkohol und reines Nelkenöl nehme ich Terpineol-Alkohol und Terpineol. Resultat: Chromatin der ruhenden Kerne dunkelblau, Nukleolus hellrot, Chromosomen bei Kernteilung rot; Chro- matin degenerierender Kerne, in Ruhe oder in Teilung: alle Abstufungen zwischen schmutzigem Braunrot und Violett; im Ovarium sind die Kerne der erwachsenen interstitiellen Zellen rot, ebenso die Blutkörperchen, was, nebenbei gesagt, das beste Zeichen eines guten Safranins ist. Protoplasma hellgelb, in degenerierenden Zellen braun; achromatische Figuren und Zellmembranen deutlich. Das Bindegewebe färbt sich stärker in gelb oder braun; Epithel und Bindegewebe- strukturen aufs schärfste ausgeprägt. Fettropfen bei Osmium- fixierung schwarz. Bei richtiger Übung gibt die Methode ausgezeichnete Resultate. 529. Weitere Modifikationen von Reinke (94) und Bonney (06 und 08) s. S. 114 und 115 der 7. Aufl. des Taschenbuches. 530. Sehr gut und in verhältnismäßig einfacher Weise gelingt die Färbung von Centrosomen, wie auch anderer Zellstrukturen mittels der Eisenhämatoxylinmethode von M. Heidenhain (§ 358f.), ev. mit Gegenfärbung durch Orange oder Lichtgrün. 531. Zur Darstellung des intergranulären Netzwerkes in der Zelle legt Altmann (92) frische Gewebestückchen für 24 Stunden in molybdänsauren Ammoniak 2,5 g; Chromsäure 138 Die Untersuchung der Zelle. § 532—537. 0,25 — 1,0 g; dest. Wasser 100 ccm. Nach 24 Stunden über- trägt man direkt in Alkohol usw. Färbung wie gewöhnlich, Hämatoxylin, Gentiana od. dgl. 532. Als Färbung für basische Eiweiße empfehlen Krugen- berg und Thielemann (18) eine Mischung von 6 Tropfen einer l%igen Wasserblaulösung + 15 Tropfen einer 0,5% igen Eosinlösung (w. g.) + 15 Tropfen einer l%igen Phloxin- lösung. Man färbt 2 — 10 Minuten, spült in Wasser kurz ab, entwässert kurz in abs. Alkohol und bringt durch Öl in Bal- sam. (Farbgemisch bei Grübler unter der Bezeichnung WEP erhältlich.) Fixierung am besten in Alkohol (s. ferner § 1320). C. Darstellung der Piastosomen (Mitochondrien, Chondriosomen). 533. Zur Lebend beobachtung von Piastosomen eignen sich u. a. Gewebekulturen. Terni empfiehlt die Geschlechts- zellen von Geotriton fuscus. Sehr schön lassen sie sich in den Zellen dünner Knorpelplättchen von Amphibienlarven, ferner in den Achselschuppen junger Elodeablättchen beob- achten. Vitalfärbung gelingt am besten mit Janusgrün (ev. auch mit Dahlia oder Methylviolett) vgl. § 463. 1. Fixierungsmethoden. 534. Vorbedingung ist Verwendung lebens frischen Materials und Fixierung möglichst kleiner Organ- stückchen (insbesondere bei den osmiumhaltigen Flüssig- keiten). An erster Stelle stehen die Methoden § 535 — 540. 535. Methode von Benda (Ol und 03): 1. Fixieren in l%iger wässeriger Chromsäure 15 ccm; 2% ige Osmium- säure 4 ccm; Eisessig 2 — 3 Tropfen, 8 Tage. 2. Waschen ca. ITStunde in dest. Wasser, dann übertragen in Acetum pyrolignosum rectificat. + l%ige wässerige Chromsäure aa. Nach 24 Stunden Abspülen mit dest. Wasser, und 3. in 2% ige wässerige Kaliumbichromatlösung. Nach 1 — ^3 Tagen (Champy) 4. 24 stündiges Auswaschen, Entwässern in stei- gendem Alkohol, Paraffineinbettung. Färbung nach Benda s. § 550, Heidenhain oder Kuli § 556. 536. Meves (08) empfiehlt für zartes embryonales Material (Hühnerkeimscheibe) 0,5% ige Chromsäure mit l%igem NaCl-Zusatz: 15 ccm, 2%ige Osmiumsäure: 4 ccm, Eisessig: 3 Tropfen. Dauer 1—8 Tage. 537. Sehr gut fixiert ferner die Altmannsche Flüssig- keit: 2% ige Osmiumsäure + 5% ige wässerige Kalium- bichromatlösung zu gleichen Teilen. Dauer: 24 Stunden, dann Auswaschen in fließendem Wasser, Alkohol usw. § 538—547. Die Untersuchung der Zelle. 139 538. Kopsch fixiert in 3%%igem Kaliumbichromat 80 ccm 4" Formol 20 ccm. Dann 3 — 4 Tage chromieren in 3,5%igem Kaliumbichromat, dann wässern usw. 539. Ganz ähnlich ist die gebräuchlichste Methode von Regaud (10): Fixierung in Kaliumbichromat 3% ig 80 ccm; Formol 20 ccm; Dauer 4 Tage, jeden Tag frische Flüssig- keit; dann Nachchromierung eine Woche in 3%igem Kalium- bichromat. Hierauf 24 Stunden Auswaschen in fließendem Wasser usw. (An gleicher Stelle noch weitere Methoden von Regaud.) 540. Champy fixiert in Kaliumbichromat 3% ig 7 ccm + Chromsäure l%ig 7 ccm -f- Osmiumsäure 2% ig 4 ccm 24 Stunden; dann Postchromierung nach Benda oder nach Regaud. Nach Kuli (13) fixiert diese Methode am besten. 541. Dubreuil empfiehlt Sublimat 5 g; Kahumbichromat 3 g; Wasser 90 ccm + Formol 10 ccm. Fixierung 3 — 4 Tage, dann 10—15 Tage in 3%igem Kaliumbichromat. 542. Kolster fixiert in Kaliumbichromatlösung 5 % ig 40,0 ; Chromalaunlösung 2% ig 40,0; Formol 20,0. Dauer 24 Stun- den; dann für 3 Tage in obige Lösung ohne Formolzusatz. Dann 24 stündiges Wässern usw. 543. Kiyono (14) fixiert in Formol oder nach Kelly (24 Stunden), wäscht einige Stunden aus und chromiert 2 Tage bei 37° C in Kaliumbichromat 5 g; Chromalaun 2 g; Wasser 100 ccm. 24 Stunden wässern usw. Nach dieser Fixierung, die auch an etwas größeren Stückchen gelingen •soll, ist auch die Altmannsche Färbung möglich. 544. Bensley (Cowdry 13) fixiert in Kaliumbichromat- ^ lösung 2,5% ig 16 ccm; Osmiumsäurelösung 2% ig 4 ccm; Essigsäure 1 — 2 Tropfen. Dauer 2 — 16 Stunden; Auswaschen 1 Stunde in dest. Wasser, dann 50-, 70-, 97%iger und abs. Alkohol je 24 Stunden und durch Bergamottöl in Paraffin. 545. Ferner s. Fixierung nach Schwitze § 371. 546. Fixierung in unverdünntem (40%igem) Formol -oder Formol 1 : Wasser 1- — 4 Teile erhält die Piastosomen nach Bang und Sjövall (15, ebenso Romeis 12) auch ohne nachfolgende Chromierung in färbbarem Zustand. Nach der Fixierung übertragen in 96% igen Alkohol. Hier auch interessante Angaben über die Einwirkung osmotischer Einflüsse auf die Form der Piastosomen. Bei Isotonie grazile fadenförmige Piastosomen, bei Hypertonie eckige Schollen, bei Hypotonie Quellung und Umwandlung in Tropfen. 547. Schon einmaliges Gefrieren mit COg verändert die Piastosomen der Leberzellen (Doyon u. Policard 12). Ebenso wird durch Erwärmen die Form rasch verändert. 140 Die Untersuchung der Zelle. § 548—550. 2. Bleichung. 548. Meistens gelingt die Färbung der Piastosomen nach Fixierung in osmiumsäurehaltigen Flüssigkeiten leichter und schärfer, wenn man die paraffinbefreiten Schnitte vor der Färbung nach der Falschen Methode bleicht. Man bringt sie dazu aus dem Wasser für 4 Minuten in eine 0,25% ige Lösung von Kai. hypermangan., sodann gleich- lang in l%ige Oxalsäure + l%ige Lösung von Kahum sul- furosum aa, worauf ausgewaschen wird (Rubaschkin 10, Meves 14). Cowdry (14) stellt 30 Sekunden in l%ige Lösung von Kai. hypermangan. und sodann 30 Sekunden in 5% ige Oxalsäure. 3. Färbungsmethoden. 549. Am leichtesten und nach all den angeführten Fixierungen gelingt die Färbung nach § 551, 552, 555 und 556. Die Schnitte sollen nicht über 5 fx sein, besser dünner. 550. Die schönste, aber auch technisch schwie- rigste Methode ist die Färbung nach Benda (Ol und 03, sowie Meves und Duesberg 08) ; die Präparate werden dazu am besten nach Bendas Angaben fixiert (§ 535). Färbung: 1. Die möglichst dünnen aufgeklebten Schnitte werden entparaffiniert und durch Alkohol in dest. Wasser gebracht. Sodann kommen sie auf 24 Stunden in eine 4% ige Eisenalaunlösung (aus violetten Kristallen her- gestellt). 2. Abspülen in dest. Wasser, dann für 24 Stunden in eine bernsteingelbe wässerige Lösung von sulfalizarin- saurem Natron (Kahlbaum), welche durch Verdünnen von 1 ccm einer gesättigten wässerigen Lösung mit 80 — 100 ccm dest. Wassers hergestellt wird. Die Schnitte müssen frei von der Farbe bespült sein. 3. Abspülen in dest. Wasser und Einlegen des Objekt- trägers (Präparat nach oben!) in eine Petrischale, welche mit der Bendaschen Kristallviolettlösung und dest. Wasser zu gleichen Teilen gefüllt ist. (Die Kristallviolettlösung ist eine 3% ige Lösung in 70%igem Alkohol, welche mit dem gleichen Volumen Anilinwasser verdünnt ist.) 4. Die Lösung wird erwärmt bis Dämpfe aufsteigen. Nach 3 — 5 Minuten wird 5. in dest. Wasser kurz abgespült und sodann in 30%iger Essigsäure differenziert (gewöhnlich 1 — 2 Minuten, unter Umständen auch kürzer oder länger). § 551 — 553. Die Untersuchung der Zelle. 141 6. Dann wird mindestens 5 — 10 Minuten in fließen- dem Wasser ausgewaschen, um jede Spur von Säure zu entfernen. Dabei tritt der durch die Ahzarinfärbung be- wirkte Farbton wieder rötlich hervor. 7. Abtrocknen mit glattem Fließpapier. Eintauchen in abs. Alkohol (Vorsicht!), Bergamottöl, Xylol, Balsam. Der für die Färbung gefährlichste Augenblick ist das Entwässern in Alkohol, da hierin das Kristallviolett sehr leicht ausgezogen wird und die Färbung dann von 3 ab wiederholt werden muß. Ist man zu hastig gewesen, so daß auch andere Zellbestandteile noch mitgefärbt sind, so differenziert man nach Entfernung des Balsams durch Xylol in einer Mischung von Kreosot und Xylol nach. Statt Bergamottöl nehme ich Terpineol. Bei richtig gelungener Färbung sind Kerne, Cyto- plasma und Idiozom braunrot; die Zentralkörperchen röt- lich violett. Einige Sekretgranula (z. B. esinophile Leuko- zytengranula) blauviolett. Die Piastosomen sind intensiv violett und sehr scharf abgegrenzt. (Auch manche Basal- membranen, Kernkörperchen usw. können, besonders wenn die Vorbehandlung nicht ganz exakt war, violett gefärbt sein; doch wird man diese Dinge bei einiger Kritik niemals mit Piastosomen verwechseln.) 551. Bei der Färbung nach Meves mit dem Heiden- hainschen Eisenhämatoxylin verfährt man nach § 358. Resultat: Piastosomen schwarz. 552. Regaud (10) beizt die aufgeklebten, ev. mit Kollodium überstrichenen Schnitte 8 — 10 Tage bei Zimmer- temperatur in 5 — 15%iger Eisenalaunlösung, wäscht einige Minuten in Wasser und färbt 24 Stunden mit Hämatoxyhn (1 g H. gelöst in 10 ccm abs. Alkohol nach Lösung wird zugefügt: Glyzerin 10 ccm; dest. Wasser 80 ccm). Diffe- renzieren in 5%iger Eisenalaunlösung. Resultat dieser guten empfehlenswerten Methode wie in § 551. 553. Cowdry (13) bekommt die Piastosomen nach folgender Methode scharf dunkelblau auf hellem Grunde (fix. nach Bens- ley § 544 oder Altmann § 537): 1. Die Schnitte kommen aus Wasser für 5 Minuten in gesättigte wässerige Lösung von Kupferazetat; 2. Auswaschen in mehrfach erneuertem dest. Wasser 1 Minute; 3. 0.5% ige wässerige Lösung von Hämatoxylin 1 Minute (wird hergestellt durch Verdünnung einer 10% igen, gut ausgereiften alkoholischen Stammlösung); 4. Abspülen in dest. Wasser; 5. 5% ige wässerige Lösung von neutralem Kaliumchromat 1 Minute. (Die Schnitte sollen hierin dunkelblau werden. Sind sie nur hellblau geworden, 142 Die Untersuchung der Zelle. § 554 — 555. so spüle man sie in dest. Wasser ab und beginne von vorne, bis kein Dunklerwerden der Farbe mehr eintritt.) 6. Aus- waschen in dest. Wasser und Zurückbringen in das Kupfer- azetat für wenige Sekunden, um allen Farbstoff in Kupfer- lack umzuwandeln. 7. Auswaschen in dest. Wasser mehrere Minuten. 8. Differenzieren unter dem Mikroskop in Borax 4,0; rotes Blutlaugensalz (Ferrizyankali) 5,0; dest. Wasser 600,0. 9. 6 — 8 stündiges Auswaschen in Brunnenwasser. 10. Entwässern, Toluol, Balsam. 664. Eine weitere von Gowdry veröffentlichte Methode Bensleys ist: Fixierung wie § 553. Einbettung in Paraffin usw. Bleichen der Schnitte nach § 548 (Gowdry). Färben: 1. 6 Minuten in Säurefuchsinlösung von Altmann bei 60°. 2. Abspülen in dest. Wasser. 3. Differenzieren in einer 1%- igen wässerigen Methylgrün- oder Toluidinblaulösung. 4. Ab- spülen in 96%igem Alkohol, abs. Alkohol, Toluol, Balsam. (Ist die Säurefuchsinfärbung nicht gut, so empfiehlt es sich oft, die Schnitte vor der Färbung für 30 Sekunden in 2,5%iges Kaliumbichromat zu stellen und dann kurz in Wasser ab- zuspülen.) Resultat: Piastosomen rot, andere Zellbestandteile grün bis braun. 555. Fäi^bung nach Altmann (nach Meves 11). Die höchstens 5 fi dicken, mit Eiweißwasser aufg;eklebten Schnitte werden nach Entfernung des Paraffins in hoher Schicht mit Säurefuchsin-Anihnwasserlösung Übergossen und über freier Flamme erwärmt, bis Dämpfe aufsteigen; sodann Abkühlen. Dies wiederholt man 1 — 2 mal und läßt dann nach vollständigem Erkalten die überschüssige Farb- lösung ablaufen. (Statt dessen kann man die Schnitte auch für 30 Minuten in die auf 60^ erwärmte, im Brutschrank stehende Farblösung bringen.) (Herstellung der Farblösung: in 100 ccm AniUnwasser (s. § 397) werden 20 g Säure- fuchsin gelöst.) Zur Differenzierung dient Pikrinsäure am besten in den von Metzner empfohlenen Konzentrationen. I. 1 Vol. gesättigte Pikrinsäurelösung in abs. Alkohol und 4 Vol. 20% igen Alkohol, II. 1 Vol. gesättigte alkohoHsche Pikrinsäurelösung und 7 Vol. 20% igen Alkohol. Mit der ersten Lösung werden 2 Gläser gefüllt: eines, um die über- schüssige Farblösung abzuspülen (ca. 15 Sekunden); in dem zweiten wird dann differenziert. Nach Abschluß der Differenzierung (ca. 1 — 3 Minuten), die man zuletzt in einem dritten, mit der Lösung II gefüllten Glas vornimmt, muß sehr gründlich in 95% igem Alkohol gewaschen werden. Dann abs. Alkohol, Xylol, Balsam. Resultat: Die Piastosomen sind scharf rot gefärbt. Die Methode empfiehlt sich besonders nach Altmannscher § 556—558. Die Untersuchung der Zelle. 143 Fixierung (§ 537), gelingt aber auch bei Fixierung nach § 535, 538, 539, 540, 542 und 543. 556. Sehr gut ist die Modifikation der Altmannschen Methode von Kuli (13). 1. Färben unter Erhitzen bis zur Dampfbildung mit dem Altmannschen Säurefuchsin (vgl. § 555). 2. Abkühlen und Abwaschen des Farbüberschusses mit dest. Wasser. 3. Fäi^ben in einer 0,5% igen wässerigen Thionin- oder Toluidinblaulösung (1 — 2 Minuten). 4. Ab- spülen mit dest. Wasser. 5. Differenzieren in einer 0,5% igen Lösung von Aurantia in 70%igem Alkohol (20—40 Sekun- den). Kontrolle mit dem Miki^oskop. 6. 96%iger Alkohol, abs. Alkohol, Xylol, Balsam. Resultat: Piastosomen inten- siv bläulich rot, Ghi^omatin blau. Protoplasma gelbbraun, Dotterkörnchen blaurot. D. Die Darstellung des Golgisdien Binnenapparates. 557. Am sichersten ist die von Cajal angegebene Urannitratmethode: 1. Kleine Stückchen von ganz frischem Gewebe (der Apparat ist sehr rasch veränderlich) kommen für 10 bis 14 Stunden in Formol 15 ccm, dest. Wasser 85 ccm, Uran- nitrat 1 g. Manchmal, besonders bei Nervenzellen, fixiert man besser in: Formol 15 — 20 ccm; dest. Wasser 80 ccm; Äthylalkohol 30 ccm ; Urannitrat 1 g.^^ 2. Nach raschem Abwaschen der Stücke in dest. Wasser (einige Sekunden) kommen sie in eine 1 — l,5%i^e Lösung von Argent. nitric, worin sie je nach Größe 36 bis 48 Stunden bleiben. 3. Nach raschem Abwaschen in dest. Wasser kommen die Stücke für 8 — 24 Stunden in folgende Reduktions- flüssigkeit: Hydrochinon 1 — 2,0 g; Formol 15 ccm; Wasser 100 ccm; Natriumsulfit (wasserfrei!) 0,5 g (d. h. eine Menge ^J^atriumsülfit, die hinreichend ist, um in dem Bade sofort eine gelbliche Färbung zu erzeugen). 4. Nach Abspülen in gewöhnhchem Wasser, Härtung in Alkohol und Einbettung in Paraffin oder Zelloidin. — Ist die Imprägnation gut gelungen, dann tritt der Golgi- Apparat schwarz auf hellem gelben Grunde scharf hervor. Am leichtesten glückt sie an embryonalem und jugend- lichem Säugetiermaterial. 558. Von besonderer Wichtigkeit für das Gelingen der Methode ist die Neutralisierung der in Formol gewöhnUch vorhandenen Ameisensäure durch Kalium-, Magnesium- oder 144 Die Untersuchung der Zelle. § 559—564. Natriumkarbonat. Sowohl das zur Lösung 1 wie Lösung 3 verwandte Formol muß unbedingt säurefrei sein. 559. Björkenheim (13) tont die Schnitte von derartig fixiertem Material nach Lösung des Paraffins sodann 1. in Lösung A: Natriumhyposulfit 30 g; Zyanschwefelammonium 30 g; dest, Wasser 1000 ccm; Lösung B: Goldchlorid lg; dest. Wasser 100 ccm. Lösung A und B vor Gebrauch zu gleichen Teilen vereinigt. 2. Sorgfältiges Abspülen in Wasser, sodann 5 — 10 Minuten Bleichen nach Veratti in übermangan- saurem Kali 0,5 g; Schwefelsäure 1 ccm; dest. Wasser 1000 ccm. 3. Kurz in 1 %iger Oxalsäure. 4. Gut waschen in dest. Wasser; 5. Färbung in Karmalaun 30 Minuten; Alkohol, Xylol, Balsam. 560. Weniger konstant sind die Resultate bei Fixie- rung nach Golgi. 1. Man fixiert 1 — 24 Stunden in käuf- licher arseniger Säure, gesättigte Lösung 100 ccm; Formol 20 ccm; 96%iger Alkohol 20 ccm; 2. Einlegen in l%iger Lösung von Silbernitrat. 24 — 48 Stunden. 3. Rasches Ab- spülen in dest. Wasser. Übertragen in Hydrochinon 2 g; Formol 5 ccm, Natriumsulfit (wasserfrei) 0,5 g; dest. Wasser 100 ccm (wird unmittelbar vor Gebrauch bereitet). Nach 24 Stunden 4. auswaschen mit Wasser, rasche Übertragung durch Alkohol in Chloroform; 5. schnelle Einbettung in Paraffin. Die Schnitte werden dann noch ev. nach § 559 vergoldet. 561. Sowohl bei § 557 wie bei § 559 und 560 tritt eine vollständige Imprägnierung des Apparates meist nur in einer schmalen Zone des Präparates ein. Von Wichtigkeit ist die Zeitdauer der Fixierung, die durch Probieren für jedes Objekt festgestellt werden muß. Häufig trifft man schon nach drei Stunden die beste Imprägnierung, die dann bei längerer Dauer wieder zurückgeht. 562. Kopsch (02) bringt kleine Gewebestückchen in 2% ige Osmiumsäure. Die Färbung des Binnenapparates beginnt ge- wöhnlich am 5. Tage. Bei Spinalganglien ist sie gewöhnhch am 8. Tage am besten, Material von Drüsen usw. braucht etwas länger. Bleibt das Objekt zu lange in der Flüssigkeit, dann verdeckt die allgemeine Schwärzung den Apparat. Ein- bettung durch Alkohol und Xylol in Paraffin. 563. Sjövall (06) fixiert 8 Stunden in Formol 1 Teil + 3 Teile dest. Wassers bei 5 — 7*^ G im Dunkeln, wäscht 1 Stunde mit Wasser aus und imprägniert 2 Tage bei 35^ C mit 2%iger Osmiumsäure. (Das Formol muß säurefrei sein!) 564. Um Binnenapparat und Plastosomengleich- zeitig darzustellen, imprägniert Hirschler (15) zuerst nach der Kopschschen Methode und bettet in Paraffin ein. Dann bleicht er die Schnitte unter Kontrolle unter dem Mikro- skop in 0,l%igem Kai. hypermanganic, bis nur mehr der 1 § 565—568. Die Untersuchung der Zelle. 145 Binnenapparat geschwärzt ist. Sodann Unterbrechen der Differenzierung mit 0,l%iger Oxalsäure, Auswaschen und Nachfärbung nach Altmann (§ 554). 565. Zur Darstellung der Trophospongien fixiert H o Im- gren (02) 24 Stunden in 2,5 — 5%iger Trichlormilchsäure und bringt durch 50-, 60-, 70-, 80- und 96% igen Alkohol (je 24 Stunden) und Xylol oder Schwefelkohlenstoff in Paraffin. Die 4 — 5// dicken Schnitte werden in Weigerts Resorcin-Fuchsin (§ 814) 24 — 48 Stunden gefärbt und durch abs. Alkohol und Xylol in Balsam gebracht. Die immer frisch hergestellte Farblösung (ca. 150 ccm) wird nach Abkühlen mit 96%igem Alkohol bis 190 ccm ver- dünnt unter Zusatz von 4 ccm Salzsäure. Mitunter wird die Färbung noch schärfer, wenn man die Schnitte nach der- selben aus dem 96% igen Alkohol noch 30 Minuten in eine 0,5% ige Chromsäurelösung legt. E. Nachweis von Fett- und Lipoidsubstanzen. 1. Neutralfette. 566. In frischen Präparaten erkennt man die Fett- substanzen der Zelle an ihrer starken Lichtbrechung. Das Auftreten und allmähliche Größerwerden der Fettröpfchen kann man besonders an Gewebekulturen sehr schön beob- achten. Durch Osmiumdämpfe lassen sich die Substanzen gut fixieren. Durch Äther, starken Alkohol, Benzol, Chloro- form, Azeton u. a. werden sie gelöst. 567. Behandelt man ganz frisch herausgenommene Fettstückchen 24 Stunden lang in einer 0,5 — l%igen Os- miumsäurelösung, so färben sich olein- und oleinsäurehal- tige Substanzen durch Reduktion des Osmiumtetroxyds zu Osmiumoxyd schwarz (primäre Schwärzung). Die übrigen oleinfreien Fette werden durch Osmiumsäure zwar fixiert, 'aber nur gebräunt. Erst nach Auswaschen mit Wasser und Nachbehandeln mit Alkohol (70 — 80% igen) tritt auch bei ihnen Schwärzung ein (sekundäre Schwärzung). Alt- mann (94). Starke. Statt in reiner Osmiumsäure kann man auch 1 — 3 Tage mit den Gemischen von Altmann, Flemming usw. fixieren, vergl. jedoch auch § 1131. 568. Das mit Osmiumsäure geschwärzte Fett löst sich mehr oder weniger leicht in Xylol, Toluol, Benzol, Äther, Kreosot, Terpentin, Thymen u. a. Schwerer geht es in Chloroform, Nelkenöl, Bergamottöl oder Terpineol in Lö- sung; am besten bleibt es in Zedernöl und in Paraffinum Romeis, Taschenb. d. mikrosk. Technik. 8. Aufl. 10 146 Die Untersuchung der Zelle. § 569—575. liquidum erhalten. Beim Einbetten in Paraffin nehme man daher statt Xylol usw. Chloroform oder Zedernöl (vgl. § 155). 569. Die osmierten Substanzen der Nebenniere (H. Rabl 91), der Thymus, der Winterschlaf drüse (Schaff er 96), der Hypophyse, der Pubertätsdrüsen u. a. lösen sich auch in Ber- gamottöl und Chloroform. Da man also beim Einbetten in Paraffin oder Zelloidin immer mit einer Lösung von osmierter Substanz zu rechnen hat, ist für exakte Untersuchungen das Schneiden der osmierten Präparate mit dem Gefriermikrotom oft vorzuziehen. 570. Häufig, insbesondere bei größeren Präparaten empfiehlt es sich, zuerst mit Formol, Orthscher Flüssig- keit od. dgl. vorzufixieren und die Osmierung an Gefrier- schnitten vorzunehmen. Der Vorgang gestaltet sich dann folgendermaßen: 1. Fixieren in Formol od. dgl. 2. Aus- waschen. 3. Schneiden auf dem Gefriermikrotom, Auf- fangen der Schnitte in dest. Wasser. 4. Osmieren der Schnitte in l%iger Osmiumsäure, Flemmingscher Lösung od. dgl. 24 Stunden [in Marchischem Gemisch (s. § 1111 bei 37^ etwa 3 Stunden]. 5. Mehrstündiges Auswaschen. 6. Untersuchen in Glyzerin, Kali aceticum, ev. vorher zur sekundären Schwärzung der oleinfreien Fette Einlegen in 80% igen Alkohol auf 24 Stunden. — Man kann dann zur Darstellung von Kern und Protoplasma noch mit Safranin oder Parakarmin und Lichtgrün nachfärben, mit abs. Alko- hol entwässern und die Präparate durch Zedernöl (1 — 2 Mi- nuten) in Paraffin, liquid, bringen und hier eindecken. 571. Sata fixiert zuerst 2 — 3 Tage in Flemmingscher Lösung und legt die Gefrierschnitte dann nochmals 24 Stun- den in Flemmingsche Lösung. 572. Über das Bleichen osmierten Fettes s. § 630 ff., ferner § 548. 573. Bei der Deutung der durch Osmiumsäure darge- stellten Strukturen ist zu beachten, daß sich unter Umständen auch fettfreie Elemente (Gerbsäure, Eleidin u. a.) schwärzen können. 574. Zuverlässiger und einfacher als die Osmiumreak- tion sind meist die Färbemethoden mit den Azofarbstoffen Sudan III oder Scharlach R (Fettponceau). Dagegen dürfen bei ihrer Anwendung die Schnitte mit höherprozentigem Alkohol nicht in Berührung kommen. 575. Färbung mit Sudan III (Daddi). 1. Man fixiert in Formol oder nach Orth. Nach Auswaschen in Wasser wird mit dem Gefriermikrotom geschnitten. Die Schnitte § 596—581. Die Untersuchung der Zelle. 147 werden in dest. Wasser aufgefangen, kurze Minuten in 50%- igen Alkohol übertragen und zur Färbung auf 20 — 30 Mi- nuten oder auch länger in Sudan III gebracht. (Man löst Sudan III in heißem 70% igen Alkohol, läßt abkühlen und absetzen. Vor dem Gebrauch wird filtriert. Das Färben muß in einem gut geschlossenen Glastubus vorgenommen werden, um Farbniederschläge durch Verdunsten des Alko- hols zu vermeiden.) Nach der Färbung spült man in 50%- igem Alkohol kurz ab und wäscht in dest. Wasser gut aus. Es empfiehlt sich meist, noch eine Kernfärbung mit Häm- alaun anzufügen. Dann deckt man nach Auswaschen mit Wasser die Präparate in Glyzerin, Glyzeringelatine, Kali aceticum oder Gelatine (§ 484) ein. Resultat: Fettsub- stanzen intensiv orange. 576. W. Rosenthal empfiehlt zur Fixierung ein Gemisch von gesättigter wässeriger Pikrinsäure (100 com) und Formol (5 com). Nach 24 Stunden Auswaschen mit Wasser. Schnei- den mit dem Gefriermikrotom usw. 577. Sudan III färbt auch oleinfreies Neutralfett, das sich bei Osmierung erst sekundäi^ im Alkohol schwärzt. Lezithin und Myelin färben sich schwach rosa. 578. Füttert man Tiere mehrere Tage mit Sudan III oder Scharlach R, so färbt sich das ganze Fett orange. Bei der Maus genügen 0,4 ccm der Farblösung (Jacobstal 09). 579. Scharlach R (Michaelis) verhält sich dem Fett- gegenüber wie Sudan III, färbt aber in der von Herx- heimer (Ol) angegebenen Lösung rascher. Vorbehandlung wie § 575 (Sudan), dann 2 — 3 Minuten in: Alkohol abs. 70,0; Wasser 10,0; 10% ige Natronlauge 20,0, dazu Schar- lach R bis zur Sättigung. — Abspülen in 70%igem Alko- hol, Auswaschen in Wasser usw. wie bei Sudanfärbung. Resultat: Fettsubstanzen rotorange. 580. Eine zweite, von Herxheimer angegebene Lösung färbt ^. noch intensiver. Sie besteht aus: 70%igem Alkohol 50,0; reinem Azeton 50,0; dazu Scharlach R bis zur Sättigung. 581. Weniger zuverlässig ist die Fettfärbung mit Nil- blausulfat (Lorrain Smith 08). Fixierung in Formol. Die Gefrierschnitte kommen 10 Minuten in eine konzentrierte wässerige Lösung von Nilblausulfat. Kurzes Differenzieren in 1% iger Essigsäure. Gründliches Auswaschen in Wasser. Einlegen in Glyzerin oder Kali aceticum. Resultat: Neu- tralfette leuchtend rot, Fettsäuren dunkelblaue glänzende Tropfen. Kerne dunkelblau, Protoplasma hellblau. Da die Fette des Gewebes jedoch meist Mischungen darstellen, so nehmen sie oft eine violette Mischfarbe an. 10* 148 Die Untersuchung der Zelle. § 582—587. 2. Fettsäuren. 582. Nachweis nach Fischler: 1. Fixierung in Formol (1 : 10); 2. Die Gefrierschnitte kommen auf 2 — 3 Stunden in eine konz. Lösung von Gupr. acetic. bei 35 — 37" C. 3. Aus- waschen in dest. Wasser. 4. Färben (mindestens 20 Minuten in folgendem, von Weigert angegebenen Hämatoxylin : Lösung a : Hämatoxylin 1,0; abs. Alkohol 10,0. Lösung b: konz. wässerige Lösung von Lithionkarbonat 1,0; dest. Wasser 9,0. Zur Fär- bung mischt man a und b und läßt vor Gebrauch einige Tage stehen. 5. Die darin überfärbten Schnitte werden in stark verdünnter Boraxferrizyankalium-Lösung (rotes Blut- laugensalz 2,5 g; Borax 2,0 g; dest. Wasser 100,0) solange differenziert, bis die roten Blutkörperchen entfärbt sind. 6. Gründliches Auswaschen in dest. Wasser. 7. Eindecken in Glyzerin oder Glyzeringelatine oder Entwässern mit abs. Alkohol, Benzin, Kanadabalsam (Xylol kann die Fettsäuren unter Umständen lösen). Resultat: Fettsäuren tiefschwarz gefärbt. Außerdem können sich noch Eisen, Kalk und die Granulationen von eosinophilen Leukozyten und von Mast- zellen färben. Man kann gleichzeitig auch noch durch Nach- färbung mit Scharlach R die Neutralfette sichtbar machen. 583. Zur Unterscheidung der Fettsäuren von Kalk bringt man die Schnitte nach dem Kupfern in 1 % ige wässerige Salzsäure, worin sich der Kalk löst. Eisen kann man durch l%ige Oxalsäure lösen. 584. Um die Kalium- und Natriunisalze der Fettsäuren, welche durch Formol gelöst werden, zu färben, fixiert man in 10%iger Formalinlösung, der bis zur Sättigung Calcium salicylicum zugesetzt ist, wodurch die genannten Seifen in wasserunlösliches fettsaures Calcium umgewandelt werden, das dann nach § 582 (Fischler) gefärbt werden kann. 585. Zur Unterscheidung zwischen Fettsäuren und Seifen bringt man die Schnitte nach dem Kupfern in Ätheralkohol, wodurch die Fettsäuren gelöst werden. 3. Cholesterin und Verbindungen desselben. 586. Die Cholesterinester der Fettsäuren färben sich mit Nilblausulfat rötlich, mit Sudan gelblichrot. Im pola- risierten Licht sind sie doppelbrechend. Die Doppelbrechung geht beim Erwärmen verloren, um beim Erkalten wieder aufzutreten. 587. Zum Nachweis von Cholesterin in Schnitten bringt Golodetz auf einen Gefrierschnitt ein Deckglas, dessen Unterfläche einen Tropfen Formalin-Schwefelsäure- Gemisch (FormaUn 30% ig 2 Teile, Schwefelsäure 5 Teile) trägt. Das cholesterinhaltige Gewebe färbt sich nach 1 — 2 Minuten stark braunrot. Reines Cholesterin schwärzt sich nicht mit Os- § 588—591. Die Untersuchung der Zelle. 149 miumlösung. Dies kann zur Unterscheidung gegenüber Olein und anderen Fetten benutzt werden, die ebenfalls die Braun- färbung auf Forrnolschwefelsäure zeigen können. In abs. Alkohol, Azeton, Äther, Benzol usw. ist Cholesterin löslich. 4. Lipoide. 588. Zur Darstellung der Lipoide fixiert man nach Ciaccio (10) kleine Stückchen 2 Tage in 5%igem wässe- rigem Kai. bichrom. 80,0; 40%igem Formol 20,0; Ameisen- säure 4 — 5 Tropfen oder besser Eisessig 5 ccm. 2. Nach- chromieren 5 — 8 Tage in 3%igem wässerigen Kai. bichrom. 3. Auswaschen 24 Stunden in fließendem Wasser. 4. Stei- gender Alkohol 24 Stunden. Abs. Alkohol 1 — 2 Stunden. Einbetten in Paraffin nach Durchführen durch Schwefel- kohlenstoff (oder Benzol). Die aufgeklebten, entparaffi- nierten Schnitte kommen aus 70%igem Alkohol, am besten in folgende Sudan III-Lösung: Äthylalkohol 80% ig 95 ccm; Azeton 5 ccm; Sudan bis zur Sättigung der auf ca. 50^ erwärmten Flüssigkeit. Nach Erkalten wird filtriert. Die Schnitte werden in dieser Lösung 14 — 1 Stunde bei 30^ G gefärbt, wenige Sekunden in 50%igem Alkohol abgespült und in dest. Wasser gut ausgewaschen. Ev. Nachfärbung mit Hämalaun. Einschluß in den Gummisirup von Apathy oder in Glyzerin. Auch Färbung mit Nilblausulfat ist mög- lich. Die Lipoide färben sich orangegelb bzw. violett oder blauviolett. 589. Kasarinoff empfiehlt zur Einbettung: Gummi arabic. 50,0 g, Rohrzucker 20 g; Wasser 50 ccm; Thymol 0,05 g. Nach Lösen bei 55° Filtrieren. 590. Zur Differenzierung der Lipoide von den Neutralfetten schheßt Ciaccio an die oben beschriebene Fixierung und Chromierung eine mehrtägige Behandlung mit der Marchischen Mischung (vgl. § 1111). Weiterbehandlung dann wie oben. Während die Lipoide sich in diesem Falle mit Sudan oder Nilblau färben lassen, erscheinen die Fette durch Reduktion der Osmiumsäure schwarz. 591. Die Chromierung macht die in Alkohol ursprünglich sehr leicht löslichen Lipoide mehr oder weniger unlöslich. Immerhin geht auch nach sehr lang dauernder Chromierung (z. B. 3 wöchentliche Härtung in Müllerscher Flüssigkeit) bei der nachfolgenden Alkoholbehandlung [nach Mayer, Schaeffer und Rathery (12, 13)] etwa die Hälfte in Lösung, bei anderen Flüssigkeiten noch mehr. Auch bei der Methode von Ciaccio gehen Fett- und Lipoidsubstanzen durch Lösung verloren (vgl. Bell. 11). 150 Die Untersuchung der Zelle. § 592 — 596. 592. Dietrich empfiehlt die Methode von L. Smith wie folgt: 1. Fixierung in Formol. Gefrierschnitte. 2. Chro- mierung der Schnitte 24 — 48 Stunden in 5%igem Kalium bichromat. bei 37^. 3. Abspülen in Wasser. 4. Färben in essigsaurem Hämatoxylin nach Kultschitzky (10% ige min- destens ein halbes Jahr alte Lösung von Hämatoxylin in abs. Alkohol 10,0 + 2% ige Essigsäure 90,0) 4—5 Stunden bei 37^. 5. Abspülen in Wasser. 6. Differenzieren in Borax- ferrizyankaliumlösung nach Weigert (vgl. § 994, 7) über Nacht. 7. Gründliches Auswaschen in Wasser. 8. Ein- schluß in Lävulose. Die lipoiden Substanzen sind blau- schwarz gefärbt. In gleicher Weise können sich Eisen, Hämoglobin und hämatogene Pigmentefärben (s. a. §1010). 593. Eine ausführhche Darstellung der Reaktionen der verschiedenen Fette und Lipoide findet sich bei Kawamura (11) und Ziveri (12). F. Nachweis von Glykogen. 594. Die zur Untersuchung auf Glykogen bestimmten Präparate müssen lebensfrisch fixiert werden, da das Glykogen postmortal sehr bald in Zucker übergeht. Wegen seiner starken Löslichkeit in Wasser ist ferner die Be- rührung mit Wasser zu vermeiden, weshalb am besten in abs. Alkohol oder im Carnoyschen Gemisch fixiert wird. Im fixierten Präparat bekommt man das Glykogen meist in Form von Tropfen oder Granulis, während es intra vitam wahrscheinlich diffus in der Zelle verteilt ist. 595. Die sicherste Methode für den Glykogennachweis ist die Jodreaktion in Vorbindung mit der Speichelreaktion. Die schönsten, klarsten Bilder gibt die Bestsche Färbung. Da sich mit derselben aber auch manches andere färbt, so muß dieselbe durch die Jodreaktion im Zweifelsfall ge- prüft werden. 596. Jodreaktion nach Langhans. Die in abs. Alkohol fixierten Objekte werden in Paraffin eingebettet. Die Paraffinschnitte werden nach § 280 aufgeklebt und durch Toluol und abs. Alkohol in Lugolsche Lösung (5 — 10 Mi- nuten) gebracht. Sodann Entwässern in abs. Alkohol, dem auf 4 Teile 1 Teil einer 10% igen Jodtinktur zugesetzt ist. Aufhellen und Einschließen in Origanumöl. Das im Prä- parat vorhandene Glykogen ist braunrot gefärbt. Bringt man die Präparate vorher mit Speichel in Berührung, so bleibt die Glykogenreaktion aus. (Unterschied gegenüber Amyloid, das sich mit Jod ebenfalls bräunt.) Die Halt- barkeit der Präparate ist nur gering. § 597—600. Die Untersuchung der Zelle. 151 597. Nach Kankato und Bleibtreu kommt im Ovarium des Frosches eine Glykogenmodifikation vor, die gegen die gewöhnhchen Jodmethoden resistent ist. Bleibtreu hat zu ihrem Nachweis eine eigene Methode angegeben. 598. Sehr schöne Präparate erhält man nach der Me- thode von Best. Man fixiert in abs. Alkohol oder nach Carnoy. Die Einbettung folgt am besten in Zelloidin oder in Zelloidin-Paraffin. 1. Intensive Kernfärbung in Hämalaun, Böhmerschem oder Ehrlichschem Hämatoxylin. 2. Gründliches Aus- waschen. 3. Färben für 5 Minuten oder länger in folgender Farblösung: Bestsche Karminstammlösung 20,0 (filtrieren)! + Liqu. Ammon. caustic. 30,0 -{- Methylalkohol 30,0. Hie- rauf direktes Übertragen (kein Wasser) zur Differenzierung in: Methylalkohol 40 ccm -(- abs. Alkohol 80 ccm -|- dest. Wasser 100 auf 1 — 5 Min., bis die erneuerte Differenzierungs- flüssigkeit klar bleibt. 5. Abspülen in 80%igem Alkohol, Entwässern, Xylol, Balsam. Resultat: Das Glykogen ist intensiv rot, die Kerne blau. Außer Glykogen färbt sich auch noch Schleim, Fibrin, Granula der Mastzellen der Magendrüsen. Herstellung der Bestschen Karminstamm- lösung: Man kocht 2 g Karmin (opt. rubr. Grübler), 1 g Kaliumkarbonat und 5 g Chlorkalium einige Minuten mit 60 ccm dest. Wasser (Vorsicht, schäumt stark!) und setzt nach Erkalten 20 ccm Ammoniak zu. Die Lösung ist so- fort gebrauchsfähig und hält sich gut verschlossen und kühl aufbewahrt im Sommer 1, im Winter etwa 2 Monate (dunkle Flasche). Vor dem Verdünnen muß filtriert werden. Die verdünnte Lösung hält sich nur wenige Tage. 599. Zelloidineingebettete Schnitte können mit wässerigen Lösungen ohne Gefahr einer Lösung des Glykogens in Be- rührung kommen. Paraffinschnitte, welche jedoch weniger gute Resultate geben, müssen nach Lösung des Paraffins und Einstellen in abs. Alkohol mit einer dünnen Zelloidinlösung Übergossen werden (Arnold). Sodann Härtung in 80*^oigem Alkohol. Zum Strecken der Schnitte beim Aufkleben nehme man warmen Alkohol (ca. 60%), um eine Lösung des Gly- kogens zu vermeiden. Glykogen ist in mehr als 55%igem Alkohol unlösHch (Röhmann 08). 600. Neukirch (09) empfiehlt zur Glykogenfixation eine mit Dextrose gesättigte, wässerige Subhmatlösung. Dann Auswaschen in 80%igem Jodalkohol, der ebenfalls mit Dex- trose gesättigt ist, Zelloidineinbettung und Färbung nach Best; für Gefrierschnitte fixiert er in 36%igem, dextrose- gesättigtem Formahn, überträgt in gesättigte Dextroselösun g 152 Die Untersuchung der Zelle. § 601—605. fängt in ebensolcher die Gefrierschnitte auf und färbt nach Best. Bei Hämalaunvorfärbung ebenfalls Sättigung mit Dextrose. 601. P. Mayer (09) löst 0,7 g Gallussäure (Grübler) in 5 ccm dest. Wasser, setzt 1,5 g Liqu. ferr. sesquichlor. (oder 0,7 g Eisenchlorid) zu, dann 1 ccm Ammoniak und füllt mit 50%igem Alkohol auf 100 ccm auf. In diese Tinte werden aufgeklebte oder unaufgeklebte Paraffinschnitte (ev. nach Vorfärbung mit Parakarmin) 10 Minuten bis einige Stunden gefärbt. Auswaschen mit 50%igem Alkohol usw., Einschluß in Balsam oder Euparal. Glykogen schwarz gefärbt. 602. Die Methode von Vastarini-Cresi (09) ist unsicher. 603. Zur gleichzeitigen Fixierung von Glykogen und Fett verdünnt Gelei (13) eine 1 — 2% ige Osmiumsäure- lösung mit gleichen Teilen abs. Alkohols. Um eine Reduk- tion der Osmiumsäure durch den Alkohol zu verzögern, setzt man etwas Natriumjodat zu und fixiert bei 0^ im Eisschrank. Das Glykogen läßt sich hierauf nach der Bestschen Methode bei 5 — 10 mal längerer Färbedauer sehr elektiv darstellen. Ferner empfiehlt Gelei Fixierung in Osmiumsäure l%ig (1 T.), Kaliumbichromat 4% ig (2 T.), abs. Alkohol (3 T.). Auch hiermit wird bei 0^ fixiert. Nach der Fixierung (24 Stunden) ward bei beiden Flüssigkeiten mit eisgekühltem 55% igen Alkohol ausgewaschen. Fixiert man mit der letztgenannten Flüssigkeit, dann kann man zur Färbung der Piastosomen gleich noch die Schultzesche Osmiumhämatoxylinfärbung im Stück anschließen. 604. Zieglwallner (11 u. 13) fixiert Glykogen und Fett gleichzeitig durch folgendes Gemisch: Trichlormilchsäure in Subst. 9 g, 2% ige Osmiumsäure 24 ccm, Eisessig 9 ccm, dest. Wasser 58 ccm oder statt dessen in 10°oiger wässeriger Chrom- säure 1,5 ccm -|- 2°oiger wässeriger Osmiumsäure 4 ccm -|- Eisessig 1 ccm + 75%iger Alkohol 13,5 ccm. Nach 10 — 12 Stunden wird mit 50*i*'oigem Alkohol 1 Stunde oder länger ausgewaschen. Paraffinschnitte können mit oder ohne Eiweiß- glyzerin mit 60%igem Alkohol aufgeklebt werden (Koagula- tion des Eiweißes, aber durch Alkohol, nicht durch Erwär- men). Färbung nach Best, Nachfärbung mit Bleu de Lyon (10 in 250 abs. Alk.) 5 Minuten. Ich ziehe die Behandlung nach § 603 vor. G. Nachweis von Fermenten. 605. Winkler (07) stellte im Protoplasma von Leuko- zyten durch Einwirkung einer l%igen schw^ach alkalischen Lösung von a-Naphthol (1 — 2 Minuten) und ebensolange Nachbehandlung mit einer l%igen Lösung von Dimethyl- § 606—609. Die Untersuchung der Zelle. 153 paraphenylendiamin blaugefärbte Granulationen dar. Die Reaktion (Naphtholblausynthese) ist durch oxydierende Fermente (Oxydasen) der betreffenden Zellen bedingt. W. Schultze (09) wies mit Hilfe dieser Reaktion, die mehr- fach modifiziert wurde, auch in vielen anderen Zellen Oxy- dasen nach. 606. Gräff (16) modifiziert die Methode wie folgt: 1. Man löst 0,5 g a-Naphthol durch Kochen in 250 bis 300 ccm dest. Wassers und läßt in brauner Flasche erkalten (2 — 3 Wochen haltbar). 2. 0,5 g Dimethyl-p-Phenylendia- min (von Merck in Glasröhrchen eingeschmolzen zu be- ziehen, da es an der Luft leicht verdirbt) werden unter leichtem Schütteln in 250 ccm dest. Wassers gelöst. Die Lösung bekommt ihre volle Färbekraft erst nach 12 bis 24 Stunden; sie ist in brauner Flasche 2 — 3 Wochen halt- bar. 3. Zur Färbung filtriert man gleiche Mengen beider Lösungen in ein Schälchen und färbt darin gut ausgebrei- tete (!) Gefrierschnitte von formolfixiertem oder frischem Material 10 — 15 Minuten unter oftmaligem Schwenken (!), bei älteren Lösungen länger. Das Gemisch ist nur für einige Schnitte brauchbar, dann erneuern. 4. Abspülen mit dest. Wasser und Einlegen für 2 — 3 Minuten in ver- dünnte Lugolsche Lösung (1 : 2 Teile dest. Wasser). 5. Ein- legen in dest. Wasser, dem einige Tropfen einer konz. wässerigen Lithionkarbonatlösung zugesetzt sind. 10 Mi- nuten bis 24 Stunden, bis die anfangs braunen Granula gebläut sind. 6. Gegenfärbung mit wässerigen Lösungen wie Alaunkarmin, Hämalaun, Eosin o. d., Abspülen in Wasser. Einlegen in Glyzeringelatine. Resultat: Die Oxy- dasegranula sind stark dunkelblau gefärbt. Die Präparate sind mehrere Monate haltbar. — Die Färbung muß mög- lichst bald nach Herstellung der Gefrierschnitte vorgenom- ^ men werden. 607. W. H. Schultze (17) erhitzt zur Herstellung der a-Naphthollösung 1 g «-N. in 100 ccm dest. Wassers zum Kochen und setzt tropfenweise soviel konz. Kalilauge zu, bis sich das geschmolzene «-N. vollständig gelöst hat. Die überstehende erkaltete Flüssigkeit ist brauchbar. Das übrige wie in § 606. Blutabstriche fixiert Schultze 2 Stunden in Formolalkohol (1 : 4). 608. Schmorl (18) empfiehlt statt Lugolscher Lösung eine konz. wässerige Lösung von Ammon. molybdaenic, da diese ^ die Schnitte ungefärbt läßt. r 609. Dopa-Reaktion. Bloch (17) will durch Behand- lung von Gewebstückchen oder Schnitten mit 3 • 4 Dio- 154 Die Untersuchung der Zelle. § 610—612. xyphenylalanin (abgekürzt »Dopa«) ein spezifisches intra- zelluläres Oxydationsferment nachweisen, durch das das Dioxyphenylalanin in Melanin übergeführt werden soll. Er betrachtet das D. als Muttersubstanz des Melanins. Technik: Man legt lebensfrische Hautstücke in lauwarme Agarlösung, läßt die Substanz durch Erkalten zu einer festen Gallerte erstarren und schneidet mit dem Gefriermikrotom. Die mögHchst dünnen Schnitte kommen bei Zimmertempe- ratur auf 24 Stunden vor Verdunsten geschützt in eine 1 bis 2% ige wässerige Lösung von Dioxyphenylalanin. Erfolgt die Reaktion zu schwach, dann färbt man im Brutschrank. Sodann wird in dest. Wasser sorgfältig abgespült, in steigen- dem Alkohol entwässert und durch Xylol in Balsam ein- gebettet. Nachfärbung z. B. mit Methylgrün-Pyronin zu- lässig. Resultat: Das Plasma der Zellen der Epidermis färbt sich diffus oder granulär gelbbraun bis schwarz. In der Kutis färben sich polynukleäre Leukozyten durch die Phenolase. 610. Nach Kreibich (18) sind ähnhche Erfolge jedoch auch mit Dimethylphenylendiamin zu erhalten. 611. Nach Matsunaga (18) fällt die Dopareaktion überall positiv aus, wo die Winkler-Schultzesche Reaktion positiv ist (z. B. Granula des myeloiden Sy- stems). M. bringt Gefrierschnitte von frischem oder noch besser von formolfixiertem Material auf 24 Stunden in eine 1 — 2% ige Lösung von Dopa wie in § 609. Die Präparate sind gut haltbar. 612. Unna (15a) nimmt seine Rongalitweißmethode zum Nachweis der Sauerstofforte der Zellen nun folgender- maßen vor: 1. Vorbereitung. Die Gewebe können frisch untersucht werden. Besser wartet man aber die agonalen Schwankungen ab und untersucht die trocken auf Eis ge- legten Stücke erst nach 24 Stunden. In jedem Fall muß das Gewebe unter der Wasserleitung von Blut befreit werden. 2. Schneiden erfolgt auf dem Gefriermikrotom in unfixiertem Zustand. Schnittdicke nicht unter 25 ytt. 3. Färbung: Man hält sich 100 ccm einer 0,5%igen Lö- sung von Methylenblau vorrätig, die man mit ca. 7 Tropfen einer 25% igen Salzsäurelösung angesäuert hat. Davon wer- den 10 ccm im Reagierglas mit 0,3 g Rongalit (Badische Anilin- und Sodafabrik oder Heraldit von Casella) bis zur Entfärbung gelinde erwärmt. (Wegen möglicher Zersetzung nicht zu stark erhitzen!) Trübt sich die wasserhelle, mehrere Tage haltbare Lösung, so wird sie filtriert. Man färbt 2 Minuten in einem Glasschälchen. Sodann überträgt man die Schnitte einzeln mit Glasnadel unter ständiger Be- wegung, um die Schnitte möglichst rasch und vollständig § 613—616. Die Untersuchung der Zelle. 155 vom Überschuß des R. W. zu befreien, in eine größere Schale mit abgekochtem Wasser. Die Bläuung erfolgt erst nach einigen (bis 10) Minuten. (Ausstrichpräparate bringt man ohne Erhitzen lufttrocken 2 Minuten in ein Stand- gefäß mit R. W. usw.) 4. Einbettung. Ist der Schnitt deutlich gebläut, dann fängt man ihn auf dem Objekt- träger auf, befreit seine Umgebung mit Löschpapier vom Wasser und läßt ihn langsam austrocknen. Nach voll- ständigem Austrocknen bedeckt man ihn mit einem Deck- glas, das mit einem Tropfen neutralen Kanadabalsams (Grübler) versehen ist. Ausstriche werden trocken auf- bewahrt. Resultat: Sauerstoff orte blau. 613. Zur Darstellung der Reduktionsorte bringt Unna (15 b) frische oder formolfixierte Gefrierschnitte (auch Alko- holfixierung und Einbettung in Paraffin oder Zelloidin ist zulässig) für 1 höchstens 5 Minuten in l%ige Lösung von Kaliumpermanganat, spült in Wasser ab und bringt durch Alkohol und Öl in Balsam. Resultat: Reduktionsorte braun. 614. Nach Schneider (14 a u. b) wird die durch das Rongalitweiß erfolgende Bläuung durch von außen zutreten- den Sauerstoff bewirkt. Ein sicherer Nachweis von primären Sauerstofforten im Sinne Unnas durch die R. W.-Methode ist gänzHch unausführbar. Ähnlich auch Oelze (14 a, b u. c). S. auch Entgegnungen von Unna (14) und Gölodetz (14). 615. Zur Feststellung chemischer Eigenschaften der Ge- webe nimmt Unna (18) »Neutralviolett extra« (Grübler). Man färbt frische, nicht fixierte Gefrierschnitte 5 — 10 Minuten in einer 0,5% igen wässerigen Lösung. Nach Abspülen in Lei- tungswasser, worin sie sich nicht weiter entfärben, kommen sie zur Differenzierung in 96% igen Alkohol, worin der über- schüssige rote Farbstoff ausgezogen wird. Meist schon nach 10—15 Sekunden kann der Schnitt in Bergamottöl über- tragen werden. Von hier Einschluß in Balsam. Nach Unna färben sich dabei die reduzierenden sauren Eiweiße des Prä- '- parates durch das Neublau des Neutralviolettes blau, die oxydierenden sauren Eiweiße durch das Neutralrot rot. Er- steres entspricht dem Reduktionsbild des Kaliumperman- ganats, letzteres dem Oxydationsbild des Rongalitweißes. H. Die Untersuchung der Pigmente. 616. Im menschlichen Organismus kann man zwischen hämatogenen und autochthonen Pigmenten unterscheiden. Zu den ersteren zählt das Hämosiderin und Hämatoidin (und Malariapigment), den zu letzteren das Abnutzungs- pigment (Lipofuchsin) und Melanin. Dazu kämen noch die meist äußerst labilen Lipochrome. 156 Die Untersuchung der Zelle. § 617—623. 617. Zur Trennung der menschlichen Pigmente ist weniger ihre morphologische Form als vielmehr ihr Ver- halten gegen Säuren, Alkalien, Fettlösungsmittel, Eisen- reagenzien und bestimmte Farben maßgebend. Die Lipo- chrome erkennt man an der Blaufärbung mit Schwefel- säure (s.^auch § 638). Dabei kommt naturgemäß der Unter- suchung des frischen, unfixierten und ungefärbten Präpa- rates ganz besondere Bedeutung zu. Zur Fixierung kommt hauptsächHch abs. Alkohol und säurefreies Formol in Be- tracht. Schwermetallhaltige und säurehaltige Flüssigkeiten sind, zu vermeiden. 618. Die Methodik der Trennung der einzelnen Pig- mente ergibt sich aus der nebenstehenden Tabelle, welche der eingehenden und wertvollen Arbeit von Hueck ent- nommen ist, auf die ich zur weiteren Orientierung beson- ders verweisen möchte. 619. Als besonders geeignete Fundstellen für Hämosi- derin gibt Hueck an: Stauungslungen und Milz; für Häma- toidin: Thromben, apoplektische Blutergüsse, Gewebe ikte- rischer Neugeborener; für Abnutzungspigment (Lipo- fuscin): atrophischer Herzmuskel, für Melanin: Haut, Auge, s. auch § 609. 620. Lipochrome finden sich im menschlichen Körper nicht sehr reichlich (z. B. Luteinzellen), man studiert sie besser an anderen Wirbeltieren. Vgl. § 640. 621. Die mannigfachen Färbungen von Haut und Hautorganen der Wirbeltiere beruhen, wie W. J. Schmidt in einer sehr wertvollen Arbeit (18) über einschlägige Unter- suchungsmethoden darlegt, auf Strukturfarben, Pigmenten oder einer Vereinigung beider (z. B. bei der grünen Haut- farbe des Frosches). Die ersten sind an meist sehr feine Strukturen geknüpft, die durch Interferenz des auffallenden Lichtes oder durch Herstellung eines trüben Mediums Farbenerscheinungen veranlassen. Dieselben werden daher verschwinden, wenn die optischen Unterschiede z. B. durch den ausgleichenden Einfluß der Einbettungsmittel besei- tigt werden (z. B. Durchtränkung blauer Vogelfedern in Balsam). 622. Weiteres über die bei Untersuchung von Struktur- farben anzuwendende Technik s. Biedermann. 623. Pigmentfarben werden dagegen durch bestimmte Farbstoffe erzeugt, die entweder an bestimmte Granula oder Kristalle gebunden sind oder diffus die gefärbte Substanz durchtränken. Zur Untersuchung der Pigmente ist die Fixierungs- wie Beobachtungsflüssigkeit so zu wählen, daß § 618. Die Untersuchung der Zelle. 157 S ö o xi Ü o a:> bß rt bc IS cc.g i4^ ^ S-i Ca I o Sä > 3 t-l "5, t-< s- fe 2 ö i H o o O Ö JQ S CO o w +-3 CO CO O Q. lU cß 'S "S OD c s bC e bß O G O bc o s icö CO O s :CÖ ö T3 O nJ S s _bü e G S o HS «5 O Sc O CO O Ü O c G aj CO >+^ G •" G CO «3 bc ö CO O et bc a;i a I og a> o ^ "^ •P Mo I c G oj .Q cö 21 a; !- (u ÖT3 G Sc"" -« 3 « 0'3:a3 !> '- C'^ !-i fi 60 0) OJ OJ ^>G O G cß a bc G I G G tH b;G 9 ^ *-• > :aj cö Ä cß -' G ^1 gj >-l Ä CO G^— ^ QJ^ t< CÜ rt 02 a^ >»' o "^ ■" S G s cß o G ai bc bü cü +j G 0) G O) bß bß na^iBqjaA^saqosiraaqoojJHK a9!^ivqj3^ saqosuaqjBj 158 Untersuchung der Melanophoren. § 624 — 628. die vielfach sehr empfindlichen Pigmente unverändert er- halten bleiben. 624. Schmidt (17) teilt die in Epidermis und Cutis vorkommenden Pigmentzellen in Melanophoren, die ein dunkles körniges Melaninpigment enthalten, AUophoren mit gelben bis roten in Alkohol u. dgl. unlöslichen Farb- körnchen, Lipophoren (= Xanthophoren, Erythrophoren) mit gelben bis roten Lipochromfarbstoffen in Form von Körnchen, Tröpfchen und Kristallen und Guanophoren (= Interferenzzellen, Iridozyten, Leukophoren usw.) mit feinkörnigen oder deutlich kristallinischen Guaninein- schlüssen. 625. Für die Untersuchung von Pigment arbeite man nicht nur mit durchfallendem Licht, sondern auch mit auffallendem, ferner mit polarisiertem Licht und mit Dunkelfeldbeleuchtung. Sehr wichtig sind Kontrolluntersuchungen am lebenden oder überlebenden Objekt. Untersuchung der Melanophoren. 626. Zur Untersuchung am lebenden Präparat eignen sich besonders die Flossensäume von Frosch-, Tri- tonen- und Salamanderlarven. Zum Studium der intra- zelluläi^en Pigmentkörnchenströmung sei besonders auf das von Ballowitz (14a) angegebene Objekt, die dorsale Hirn- haut von Gobius minutus, verwiesen. Die gleichen Objekte, ferner Fischschuppen, eignen sich auch zur Herstellung von Dauertotalpräparaten. Da das Melanin sehr wider- standsfähig ist, bietet die Fixierung keine Schwierigkeit. Schmidt empfiehlt besonders Alkoholformol und Färbung mit Delafieldschem Hämatoxylin. Über den Einfluß äußerer Faktoren auf Expansion und Ballung der Pigmentzellen siehe insbesondere van Rynbeck (06) und Fuchs (14). 627. Im polarisierten Licht sind die Melaninkörnchen ein- fach brechend, bei Dunkelfeldbeleuchtung leuchten sie hell, weißhch auf. 628. Zur Herstellung von Schnittpräparaten fixiert man in Sublimatgemischen oder nach Flemming. Beim Einbetten in Paraffin nehme man Chloroform oder Zedernholzöl. Färbung besonders mit Eisenhämatoxylin. Bei Färbung mit basischen Anilinfarben nehmen die Me- laninkörnchen in ungebleichtem Zustand vielfach noch Farbe an, wodurch bestimmte Mischfarben entstehen (vgl. Unna 13), weshalb zur Feststellung der Eigenfarbe in un- § 629 — 635. Untersuchung der Allophoren. 159 gefärbtem oder frischem Zustand untersucht werden muß, Osmiumsäure wird ebenso wie Silbernitrat durch Melanin reduziert. 629. Die Vorstufe des Melanins läßt sich nach Bloch durch die von ihm angegebene Dioxyphenylalaninreaktion (Dopa, s. a. § 609) sichtbar machen. 630. Zur Bleichung von Pigmenten (wie auch von chromierten und osmierten Präparaten) wurde Wasserstoff- superoxyd in 3 — 10%iger Lösung empfohlen (Unna 83, Solger 83). Dasselbe wirkt jedoch ziemlich stark maze- rierend (P. Mayer 07, Fürst 96). 631. Die stärkste und sicherste Bleichung ohne tiefe Schädigung der Präparate läßt sich mit freiem Chlor nach P. Mayer (08 und 10) erzielen. Man befeuchtet dazu einige Kristalle von Kaliumchlorat auf dem Boden eines gut verschließbaren Färbeglases mit etwas Salzsäure und füllt, wenn kräftige Ghlorentwicklung eingetreten ist, vorsichtig mit 96%igem Alkohol auf, der sich durch das entstehende Ghlorgas grün färbt. In diesen Chloralkohol stellt man die mit Eiweiß aufgeklebten Schnitte. Das Fortschreiten der Bleichung, die meist einige Stunden dauert, wird unter dem Mikroskop kontrolliert. 632. Man kann die Bleichung hier wie bei den folgenden Methoden auch am nichtentparaffinierten Schnitt vor- nehmen. Die Dauer des Vorganges wird dadurch zwar ver- längert, die Schädigung des Schnittes jedoch vermindert. 633. Alfieri bleicht mit Kaliumhypermanganat 1 : 2000, bis das Pigment entfernt ist; hierauf kommen die Schnitte zur Entfernung des entstandenen Manganoxyds in 0,3% ige Oxalsäure. Sobald sie wieder weißlich sind, werden sie sorgfältig gewässert. Zu lange Einwirkung der Oxalsäure ist schädlich. Diese Methode wird auch zur Blei- chung von Osmiumpräparaten viel benutzt (s. § 548). 634. Carazzi (09) nimmt eine 2,5% ige wässerige Lösung von Natriumperborat (im Handel unter dem Namen Oxyhthe "' erhältlich), der etwas Zitronen- oder Weinsäure zugesetzt wird, wodurch die Sauerstoffentwicklung gesteigert wird. Bei alkoholischer (60 — 70%iger) Lösung ist dieser Zusatz unerläß- Hch. Das weiße Pulver läßt sich gut aufkleben. Die Schnitte bleichen ziemlich schnell, wenn das Präparat nach der Fixie- rung gut ausgewaschen wurde. Ihre Struktur und Färbbar- keit wird nur wenig beeinträchtigt. Untersuchung der Allophoren. 635. Dieselben enthalten einen alkoholunlöslichen, gelb bis rot gefärbten Farbstoff. Im polarisierten Licht sind sie einfach brechend. Bei Dunkelfeldbeleuchtung ent- 160 Untersuchung der Lipophoren. § 636 — 640. stehen oft sehr farbenprächtige Bilder. Fundort: In der Haut von Knochenfischen (vgl. Ballowitz 13 a u. b), von Reptilien (Chamäleon, Eidechsen, Schlangen) und Amphi- bien (z. B. Rana fusca). 636. Zur Fixierung eignen sich besonders Alkohol und Sublimat. Stark saure Fixierungsflüssigkeiten können den Farbstoff angreifen. Durch Zerstörung gleichzeitig vorhandener Guanophoren mit Hilfe von Alkalien lassen sich die Allophoren stärker hervorheben. Ist das nicht möglich, so untersuche man guaninarme und -freie Stellen. 637. Neben Balsamtotalpräparaten kann man auch Schnitt- präparate untersuchen (am besten ungefärbt, da die Allo- phorengranula künstliche Farbstoffe stark speichern können, wodurch die natürliche Farbe verdeckt wird). Ist man, wie bei Hautverknöcherungen, gezwungen zu entkalken, so gehen die AUophorenfarbstoffe meist zugrunde. Untersuchung der Lipophoren. 638. Die meist sehr labilen Farbstoffe sind in Fetten und deren Lösungsmitteln löslich. Häufig sind sie sehr lichtempfindlich und bleichen rasch aus. Bei Zusatz von Schwefelsäure tritt ein Farbumschlag in Blau bis Blaugrün ein. Sie kommen in Fetten gelöst als kleine gefärbte Tröpf- chen oder als winzige Körnchen und stäbchenförmige Kri- stalle (bzw. Kristallite) vor, die in polarisiertem Licht doppelbrechend sind. 639. Als Untersuchungsobjekt in überlebendem Zu- stand eignet sich besonders der Hinterrand der dachziegehg sich deckenden Bauchschilder unserer Eidechsen (Schmidt 17). Man biegt das Tier so, daß die Bauchseite vorgewölbt ist und die Schuppen sich voneinander spreizen. Dann schneidet man mit einer gekrümmten Schere den 0,5 — 1,0 mm breiten feinen Hinterrand der Schuppe ab, bringt sie — die Außen- seite dem Deckglas zugekehrt — in phys. NaCl-Lösung und umrandet mit Wachs. Auch Gefrierschnitte von unfixiertem Material (Haut vom Frosch, Salamander, Mundschleimhaut junger Vögel) sind geeignet. Die Schwefelsäurereaktion ist an dünnen Hautstücken oder Gefrierschnitten auszuführen, wobei die Säure konzentriert und reichlich zugesetzt werden muß. Störende Guanophoren können ohne Schädigung der Lipophoren durch NaOH oder KOH gelöst werden. 640. Die Herstellung von Dauerpräparaten wird durch die Löslichkeit des Farbstoffes sehr erschwert. Am besten ist noch das Einlegen des frischen Objektes in Gly- zerin. Nur bei einigen Lipophoren, z. B. Epidermis von erwachsenem Feuersalamander, in der Cutis von Triton-, 1 § 641 — ^43. Untersuchung der Guanophoren. 161 Salamander- und Froschlarven ist der körnig-kristallinische Farbstoff so widerstandsfähig, daß man kleine Stückchen in abs. Alkohol rasch entwässern und durch Zedernholzöl rasch in Balsam überführen kann. Untersuchung der Guanophoren. 641. Die Guaninkristalle sind im polarisierten Licht doppelbrechend, was besonders zur Auffindung kleiner Mengen sehr wertvoll ist. Dabei ist aber zu beachten, daß ein Teil der Kristalle infolge Zusammenfallens der optischen Achsen dunkel bleiben kann. Beim Einschalten des Gipsplättchens Rot 1. Ordnung treten lebhafte Inter- ferenzfarben auf. Für die Beobachtung bei Dunkelfeld- beleuchtung empfiehlt sich Einschluß in säurefreien Kanada- balsam. 642. Durch Säuren oder Alkalien wird das Guanin gelöst. Man fixiere also in Alkohol oder Sublimatgemischen. Auch in Formol können die Kristalle nach längerer Zeit verschwinden. Ferner werden sie von alaunhaltigen Farb- lösungen angegriffen. Ballowitz (14a) färbt mit schwacher, gut tingierender Hämatoxylinlösung (wohl Hämatein), Schmidt nimmt Delafieldsches Hämatoxylin. Zur Unter- suchung von Kern und Protoplasma kann man das Guanin durch Einstellen der Schnitte in 5%iger Eisenalaunlösung entfernen. I. Nachweis anorganischer Substanzen. a) Eisennachweis. 643. Der Nachweis von Eisen soll möglichst an lebens- frischem Material erfolgen. Zur Fixierung nimmt man am besten abs. Alkohol ; doch ist auch säurefreies Formol, zu- -mal wenn es nicht zu lange einwirkt, verwendbar (Hueck 12). Auch eine Nachbehandlung des alkoholfixierten Mate- rials mit Formol ist zulässig. Zu verwerfen ist dagegen Fixierung in Flüssigkeiten, die Schwermetalle wie Kupfer, Chrom u. dgl. enthalten. Sämtliche mit den Präparaten in Berührung kommende Flüssigkeiten sollen eisenfrei sein, insbesondere das zum Auswaschen benützte dest. Wasser. Die Gläser sind vorher durch sorgfältiges Putzen mit war- mer Salzsäure, Wasser und Alkohol von Eisenspuren zu reinigen. Metallspatel, Eisennadeln u. dgl. sind durch solche aus Glas zu ersetzen. Am einfachsten arbeitet man mit Rom eis, Tasclienb. d. mikrosk. Technik. 8. Aufl. H 16^ Nachweis anorganischer Substanzen. § 644 — 648. dem Gefriermikrotom, doch ist auch Paraffin und insbeson- ders Zelloidineinbettung möglich. 644. Die einzige absolut zuverlässige mikro- chemische Reaktion auf Eisen ist nach Hueck die mit konzentriertem Schwefelammonium und Überfüh- rung des Schwefeleisens durch Ferrizyankaliumsalz- säure in Turnbullblau (Methode von Tirmann und Schmelzer). Ausführung: Die Schnitte kommen aus dest. Wasser in konzentriertes, etwas gelb gefärbtes Schwefelammonium für 1 — 24 Stunden. Dann sorgfältiges Abspülen in dest. Wasser und Übertragen in eine frischbereitete Mischung von 20%iger Ferrizyankaliumlösung und l%iger Salzsäure zu gleichen Teilen für 10 — 20 Minuten. Dann sorgfältiges Abspülen in dest. Wasser, Nachfärbung mit Parakarmin zur Darstellung der Kerne usw. Resultat: Das Eisen ist leuchtend blau gefärbt. 645. Die Schwefelammoniumlösung soll rein gelb gefärbt sein. Sie darf also nicht älter als 3 Wochen sein und nicht offen an der Luft gestanden haben, wobei sie bräunlich-gelb und unwirksam wird. 646. Weniger genau ist die Berlinerblaureaktion. Am besten führt man sie nach Wicklein-Falkenberg aus, in- dem man die Schnitte für 30 — 60 Minuten aus dest. Wasser in eine frisch hergestellte Mischung von 25 ccm l%iger Salz- säure und 8 — 10 Tropfen einer frisch hergestellten 2%igen Ferro zyankaliumlösung bringt. Hierauf wird sehr sorgfältig mit dest. Wasser ausgewaschen und entweder mit Karmalaun oder Parakarmin (nicht Lithionkarmin) zur Darstellung der Kerne nachgefärbt. 647. Die Methoden von Perls, Hall, Quincke u. a. sind weniger zuverlässig. 648. Für den Nachweis organischer oder maskierter Eisenverbindungen gibt Mac all um (12) folgende Methode an: 1. Herstellung des Reagens (saures Ammonium- sulfid). Man leitet in eine Ammoniaklösung (Dichte 0,96) so lange Schwefelwasserstoff, bis der Ammoniakgeruch ver- schwunden ist und HgS- Geruch auftritt. 2. Ausführung der Reaktion: Ein Schnitt von alkoholfixiertem Material wird auf dem Objektträger in einem Tropfen Glyzerinwasser (dest. Wasser • — chemisch reines Glyzerin ää) mit Glasnadeln fein zerzupft, bis die Zellen möglichst isoliert sind. Sodann setzt man einen Tropfen des Sulfidreagens zu, mischt und legt vollkommen eben ein Deckglas auf. Dann läßt man das Präparat einige Tage bis 2 Wochen im Thermostaten bei 60^ C liegen. II § 649 — 651. Nachweis anorganischer Substanzen. 163 Nach 2 Tagen beginnt an den Kernen Grünfärbung ein- zutreten, die sich allmählich zu Dunkelgrün verstärkt. 649. Schnitte bringt man auf 1—4 Tage bei 35—40" G in schwefelsauren Alkohol (abs. Alkohol 100,0; Schwefelsäure (spez. Gew. 1,84) 4,0). Vom 2. Tage ab ist der Eisennach- weis möglich. Man wäscht dazu in dest. Wasser ab und bringt den Schnitt in eine frisch bereitete Mischung einer frischen l,5%igen wässerigen Ferrozyankaliumlösung (1 Teil) und einer 0,5%igen Salzsäure (1 Teil). Nach 30 Minuten Waschen in dest. Wasser, abs. Alk., Xylol, Balsam. Eisen blau. Die Resultate dieser Methode sollen aber durch Me- thode § 648 kontrolliert werden. Die Sicherheit der in § 648 und § 649 angegebenen Me- thoden wurde mehrfach angezweifelt [vgl. Zacharias (10), Hueck (12), Wiener (16)]. b) Nachweis von Kalium. 650. Macallum benützt dazu die Eigenschaft des Kobaltnitrits mit Kalium einen orangegelben Niederschlag zu geben. Herstellung des Reagens: 20 g Kobaltnitrit und 35 g chemisch reines Natriumnitrit werden in 75 com verdünnter Essigsäure (10 ccm Essigsäure auf 65 ccm dest. Wasser) gelöst. Nach einigen Stunden wird filtriert und auf 100 ccm aufgefüllt. Aufbewahren im Eisschrank. Nachweis: Gefrierschnitte frischer Organe werden noch in gefrorenem Zustand (um eine Verlagerung des Kaliums durch Diffusion zu verhindern) in das Reagens gebracht. Man schneidet daher mit stark gekühltem Messer (möglichst unter 0°). Nach 1/9 bis mehreren Stunden wird das Reagens abgesaugt und durch eisgekühltes Wasser ersetzt, das nach etwa 3 Minuten erneuert wird. Dies wird in 20 Minuten 5 — 6 mal wiederholt. Dann breitet man den Schnitt auf dem Objektträger flach aus. Da die orangerote Färbung in geringen Mengen schwer sichtbar ist, führt man sie in eine schwarze über. Man bedeckt dazu mit einem Tropfen Glyzerin- Ammo- niumsulfid (s. § 648), Spermatozoen oder einzelne Zellen rührt man 30 Minuten mit dem dreifachen Volumen des Reagens an, dann mehrmaliges Auswaschen mit eisgekühltem Wasser (mit Hilfe der Zentrifuge oder auf Filtern mit Saugpumpe), Glyzerin-Ammoniumsulfid usw. Auch gegen diese Reaktion Macallums wurden verschiedene Bedenken vorgebracht. (Vgl. Liesegang 14, 469.) c) Nachweis von Calcium. 651. Methode von Grandis und Mainani (00), Ausführung an frischem oder alkoholfixiertem Material, 11* 164 Nachweis anorganischer Substanzen. § 652 — 654. Gefrier- oder Paraffinschnitte. Färbung in gesättigter alko- hoUscher Purpurinlösung bis stark rotgefärbt (5 — 10 Mi- nuten). Sodann in 0,75% ige Kochsalzlösung. Nach einigen Minuten wird in 70%igem Alkohol gew^aschen, bis keine Farbe mehr abgeht. Dann abs. Alkohol, Xylol, Balsam. Calciumhaltiges Gewebe ist purpurrot gefärbt. Zum Nach- weis von Ca im Zellprotoplasma ist die Methode nicht empfindhch genug. 652. Methode nach Kossa (Ol): Fixieren in Al- kohol. Gefrier- oder Paraffinschnitte von unentkalktem oder nicht ganz entkalktem Material kommen aus dest. Wasser auf 10 — 60 Minuten bei starker Belichtung in 5% ige Silbernitratlösung. Auswaschen in dest. Wasser. Einige Minuten in 5% ige Natriumthiosulfatlösung (vorher ev. noch Einlegen in dünne Pyrogallussäurelösung). Sorg- fältiges Auswaschen. Ev. Nachfäi^ben mit Safranin. Abs. Alkohol usw. Kalk tiefschwarz. Empfindlichkeit wie bei § 651. Fehlerquellen durch Reaktion mit Fettsäuren oder mit Chloriden, Phosphaten, Sulfaten, Karbonaten anderer Basen möglich. 653. Für den Nachweis sehr kleiner Mengen hat Macallum folgende Methode ausgearbeitet: 1. Rea- genzien: a) Schwefelsäurehaltiger Alkohol [2 ccm H2SO4 (spez. Gew. 1,84) und 100 ccm abs. Alkohol]; b) Bleiacetat- TZ lösung in —-Verdünnung; c) Lösung von Glyzerin- Ammo- niumsulfid vgl. § 648. 2. Ausführung der Reaktion: Gefrierschnitte kom- men wie in § 650 gefroren in das Reagens a). Nach 20 Mi- nuten sorgfältiges Auswaschen in abs. Alkohol, dann in Reagens b). Nach 30 Minuten sehr sorgfältiges Waschen in dest. Wasser, dann Einlegen in Reagens c). Calcium- haltige Bestandteile schwarz gefärbt. Unter Umständen kann man nach der Behandlung mit Bleiazetat 2 — 3 Minuten mit —-Salpetersäure waschen, um etwa vorhandenes Bleiphosphat zu entfernen. Dann Aus- waschen usw. Auch hier muß mit der Möglichkeit von Fehler- quellen gerechnet werden. 654. Über Methoden zum Nachweis von Kupfer, Chlor, Jod, Phosphor, Schwefelsäure und Salzsäure siehe Macallum 12. Vgl. ferner § 1223. I § 655—658. Epithelien und Endothelien. 165 14. Kapitel. Die Untersuchung von Epithelien und Endothelien. 655. Zur irischen Untersuchung werden die Epithe- lien durch leichtes Abschaben einer epithelbekleideten Ober- fläche mittels eines scharfen Messers gewonnen. Zur Ent- nahme von Pflasterepithelien eignet sich u. a. die Zungen- oberfläche. Zur Beobachtung der Flimmerepithelien dienen als klassische Objekte die Gaumenschleimhaut der Frösche oder die Kiemenplättchen der Muscheln, ferner die Leber- gangzellen der Schnecken. Auch viele in der Harnblase und Kloake des Frosches anzutreffende Parasiten haben flimmernde Oberfläche. Die Epithelbewegung untersucht man am besten an explantierten Hornhautstückchen (vgl. Oppel 12c). 656. Als Untersuchungsflüssigkeit frischer Ob- jekte dient physiologische Kochsalzlösung oder Ringer- lösung (vgl. § 50). Durch Zusatz schwacher Säuren und Alkalien läßt sich der Einfluß auf die Flimmerung studieren [Kalilauge (1 : 1000 Wasser) wirkt z. B. erregend]. Will man die Flimmerbewegung zur besseren Beobachtung ver- langsamen, dann setzt man zur Beobachtungsflüssigkeit etwas Gummilösung. In Zungen- oder Mundhöhlenabstri- chen findet man neben Plattenepithelien und zahllosen Bak- terien Speichelkörperchen, in deren Protoplasma häufig zahlreiche in Brownscher Molekularbewegung befindliche Körnchen eingelagert sind. 657. Um über die Form von Epithelzellen ins Klare zu kommen, ist es oft nötig, die einzelnen Epithelzellen zu isolieren. Dies geschieht durch Einlegen von lebens- frischen, nichtfixierten Epithelfetzen oder von Stücken epithelial ausgekleideter Organe (z. B. Darm, Trachea) in IsoIierungs-(Mazerations-)Flüssigkeiten. Dabei soll die Flüs- sigkeitsmenge etwa dem gleichen oder höchstens doppelten Volumen des zu mazerierenden Organs entsprechen, da bei reichlicher Flüssigkeit die fixierende Wirkung oft über- wiegt. Durch Einwirkung bei erhöhter Temperatur (37^ C) läßt sich der Prozeß beschleunigen. Nach einer gewissen Zeit können die Zellen dann durch einfaches Schütteln, Klopfen oder Zupfen isoliert werden. Man untersucht in der Isolierungsflüssigkeit oder in Glyzerin, dem man unter Umständen auch etwas Farbstoff wie Eosin oder Pikro- karmin zusetzen kann. 658. Zu den besten Isolationsmitteln für Epithelien gehört der sog. Drittelalkohol von Ran vier (30 ccm 96% iger 166 Epithelien und Endothelien. § 659—663. Alkohol + 70 ccm Wasser). Nicht allzu große Stückchen eines frischen Epithels werden 12 — 24 Stunden in wenig Flüssigkeit eingelegt. Für gewöhnlich gelingt die Isolierung dann schon durch einfaches Schütteln oder durch leichtes Beklopfen der auf einen Objektträger gelegten Stückchen mit einer Zupfnadel. Die Zihen der Fhmmerepithelien bleiben bei Einwirkung des Drittelalkohols erhalten. Auch eine nachträghche Färbung ist möglich. Noch besser ist die Erhaltung der Flimmerzellen bei Mazeration in stark ver- dünnter Müllerscher Flüssigkeit (10 ccm auf 1000 Wasser), die man bis zu mehreren Wochen einwirken läßt (Kampfer- zusatz). Ewald (97) fixiert nach der Isolierung mit Drittel- alkohol noch mit 0,5% iger Osmiumsäure und wäscht einige Male aus. Weitere Isolationsmittel für Epithelien sind: 659. Osmiumsäure 1 : 1000. Man mazeriert kleine Stückchen 24 Stunden und länger, wäscht mit Wasser und zerzupft in W^asser oder in Glyzerin; ferner Jodserum nach M. Schultze (s. § 51). 660. Wässerige Chromsäurelösung 1 : 1000. Dauer der Einwirkung 24 Stunden bis Wochen. Thymol oder Kamp- ferzusatz. Ebenso wirkt 0,5 — l%ige Kalium- oder Am- moniumbichromatlösung. 661. In wenigen Stunden mazeriert 1 — 2% ige Natrium- fhioridlösuug. Für Epidermis, Linsenfasern, glatte Muskel- zellen u. a. geeignet (Levi 04). 662. Zum Auswaschen von mazerierten Gewebsfrag- menten läßt man in einem Spitzglas absetzen und hebert dann die über dem Bodensatz stehende Flüssigkeit mit einem Heber nach Mays ab. (Bei demselben ist der in die Flüssigkeit versenkte kürzere Heberschenkel am unteren Ende nochmals nach oben umgebogen und dann kurz über der Biegung abgeschnitten, so daß die Öffnung des Rohres nach oben gerichtet ist.) Mit einem derartigen Heber kann, zumal wenn man das Rohrlumen ziemlich eng nimmt, die Flüssigkeit fast bis zum letzten Tropfen abgehebert werden, ohne etwas vom Bodensatz mitzureißen. 663. Am einfachsten behandelt man aber vorher iso- herte Zellen und Fasern mit einer Zentrifuge, mit deren Hilfe sich der ganze Prozeß des Auswaschens, Färbens, Ent- wässerns usw. ohne Materialverlust viel rascher und exakter durchführen läßt als beim einfachen Sedimentierungsver- fahren. Natürhch muß man nach jedem Flüssigkeitswechsel den Bodensatz wieder ^ut aufschütteln. § 664—667. Epithelien und Endothelien. 167 664. Bei Beobachtnng frischer Epithelien oder Endo- thehen von der Fläche her sind die Zellgrenzen gar nicht oder nur sehr undeutlich sichtbar. Um diese hervortreten zu lassen, bedient man sich der sog. Versilberungsmethode (Ranvier 68 und 89). Man spült dazu frische Membranen, Mesenterien, Peri- kardstücke, aufgeschnittene dünne Gefäße, aufgeblasene Lungenalveolen usw. kurze Zeit mit dest. Wasser ab, um etwa anhaftende Blut- und Eiweißflüssigkeit fortzuschwem- men, überträgt in eine 0,5% ige wässerige Silbernitratlösung und läßt die Stücke so lange darin, bis sie anfangen, un- durchsichtig zu werden. Ist das eingetreten, so werden die Stücke in viel dest. Wasser übertragen und an einem von der Sonne beschienenen Orte so lange stehen gelassen, bis sich die Stücke zu bräunen beginnen. Daraufhin werden sie noch einige Male mit dest. Wasser tüchtig abgespült und entweder in Glyzerin od. dgl. untersucht oder allmäh- lich in abs. Alkohol übertragen, wobei für eine geeignete Spannung der Membranen (z. B. Aufspannen mit Nadeln auf einem Kork) Sorge zu tragen ist. Xylol, Kanadabalsam. An solchen Stückchen erscheinen, wenn die Versilberung gelungen ist, die Zellgrenzen resp. die Kontaktflächen der Zellen schwarz, während Zelleib und Kerne gar nicht oder nur wenig imprägniert sind. Eine nachträgliche Färbung der Kerne, etwa mit Parakarmin, Hämalaun od. dgl. ist zulässig. Sie wird am besten nach dem Behandeln mit Alkohol eingeschoben. 665. Achard und Aynaud führen die Schwärzung der Kittlinien auf das Vorhandensein von Kochsalz in den Kitt- substanzen zurück. 666. Die Zellgrenzen wurden an der Epidermis mit Silber- nitrat 1844 zum ersten Male von C. Krause dargestellt und in einer. Dissertation, die 1854 unter Coccius erschienen ist, - hat Flinser darauf aufmerksam gemacht, daß nach der Ätzung des Hornhautepithels mit einem Höllensteinstift Niederschläge zwischen den Zellen entstehen. 667. Als Lösungsmittel für Silbernitrat kann statt des Wassers auch eine 0,5% ige Osmiumsäure (R. und 0. Hertwig) oder eine 2 — 3% ige Salpetersäure genom- men werden, wodurch gleichzeitig auch eine fixierende Wir- kung ausgeübt wird. Man lasse die Flüssigkeit etwa eine Viertelstunde einwirken, wasche etwa eine halbe Stunde mit dest. Wasser ab, übertrage in 70%igem Alkohol, färbe ev. nach (Hämalaun oder Karmin) und überführe in Kanada- balsam nach bekannten Regeln. 168 Epithelien und Endothelien. § 668—672. 668. 0. Schultze (07) lässt eine 2%ige Silbernitrat- lösung mit 0,1% Osmiumsäuregehalt während 30 Minuten einwirken. Dann spült er kurz mit dest. Wasser ab und reduziert in vollem Sonnenlicht mit l%iger Hydrochinon- oder Pyrogallussäurelösung. Man kann auch erst für 24 Stunden in eine 0,5% ige Osmiumsäure und dann eben- solange eine 2% ige Silbernitratlösung einwirken lassen. Dann abspülen und reduzieren wie oben. 669. Bei allen Versilberungsmethoden ist der Kontakt von gewöhnlichen Blechspateln, eisernen Nadeln, Pinzetten etc. mit Silberlösungen auf das sorgfältigste zu vermeiden. Man kann sich leicht mit improvisierten Instrumenten helfen, die man sich aus Holz, Hörn, Borsten, Stacheln usw. zusammenfügt. Statt Nadeln benützt man Igelstacheln; zwei geeignet zugeschnittene Stückchen Hörn oder Holz in der Verlängerung einer ge- wöhnlichen Pinzette festgebunden, ein Holzspatel oder Hornlöffel u. dgl. werden im allgemeinen genügen. 670. Das Schhißleistennetz stelle man nach S 358 dar. 671. Um Interzelhilarbrücken darzustellen, empfahl Ko- lossow (92): Feine Membranen, kleinste Gewebsstücke (auch vorher fixierte Stücke), kommen auf kurze Zeit (etwa y^ Stunde) in eine Yz — l%ige Osmiumsäure oder in Alkohol 50 ccm, Wasser 50 ccm, Acid. nitr. conc. 2 ccm, Osmiumsäure 1 — 2 g und dann in eine 10% ige wässerige Tanninlösung oder den sog. Entwickler: Wasser 450, 85 %iger Alkohol 100, Glyzerin 50, Tannin puriss. 30, Pyrogallussäure 30. (Zur Darstellung des Entwicklers werden 30 g Tannin in 100 Wasser gelöst, nach 1 oder 2 Tagen wird filtriert, zum Filtrat gibt man 30 g Pyro- gallussäure, die in 100 ccm Wasser gelöst sind, und darauf die übrige Quantität Wasser, den Alkohol und das Glyzerin). Im Entwickler verbleiben die Stücke einige Minuten, werden dann 5 Minuten in einer schwachen Osmiumsäure abgespült, Waschen mit destilhertem Wasser, Alkohol etc. 672. Bei einer späteren Methode spült Kolossow (98) die Blutgefäße der zu untersuchenden Organe mit 0,6%iger Kochsalzlösung aus und injiziert dann folgende Lösung: 0,5% ige wässerige Osmiumsäure 100 ccm; 0,5 bis 1 ccm einer 30% igen Salpetersäure; 1 ccm Eisessig; calium nitricum 10 — 12 g. Die nach kurzer Zeit (Y^ — % Stunde) in kleine Stücke geschnittenen Organe kommen dann auf 16 — 24 Stunden in 0,5% ige Osmiumsäure und ebensolange in 10%ige Tanninlösung, die solange zu wechseln ist, bis die Schwärzung verschwindet. Wasser, 70%-, 85%-, 96%- iger und abs. Alkohol usw. Einbetten in Paraffin. Färbung nicht nötig. § 673—675. Epithelien und Endothelien. 169 673. Woronin (98) färbt Schnitte 10 Minuten oder länger in l%iger Osmiumsäure, behandelt sie ebenso- lange mit gesättigter Tanninlösung, überträgt sie noch- mals auf etwa 20 Minuten in l%ige Osmiumsäure und wäscht längere Zeit mit abs. Alkohol. 674. Zur Darstellung von Zellgrenzen, Flimmerhaaren mit basalen Knötchensäumen und insbesondere auch von Protoplasmafasern der sog. Stachelzellen (Faserzellen) eignet sich sehr gut die Unnasche Wasserblau- Orcem-Eosin-Fär- bung. Fixierung in Orthscher Flüssigkeit, Pikrinsäuresubli- mat, Formolalkohol oder auch Formol. Zur Färbung be- nötigt man folgende Farblösungen: Lösung I: Wasserblau 1 g, Orzein 1 g, Eisessig 5 ccm, Glyzerin 20 ccm, 96%iger Alkohol 50 ccm, dest. Wasser 100 ccm. Lösung II: Eosin (alk. lösl.) 1 g, abs. Alkohol 80 ccm. Lösung III: Hydro- chinon 1 g, dest. Wasser 100 ccm. Zur Färbung der dünnen (5 ^i), mit Eiweiß aufgeklebten Paraffinschnitte mischt man 10 ccm der Lösung I mit je 3 ccm der Lös. II. u. III. Nach 10 Minuten spült man in dest. Wasser ab, färbt 10 Minuten in l%iger wässeriger Lösung von Safranin (Grübler), spült in dest. Wasser ab und stellt für 10 — 30 Minuten in eine 0,5% ige wässerige Lösung von Kaliumbichromat. Sodann Abspülen in dest. Wasser, Alkohol, Toluol, Kanadabalsam. Die Schnitte sollen violett aussehen. Die verschiedenen Faserstrukturen färben sich dabei sehr scharf. 675. In Organen mit gemischtem Epithel (Pflaster- und Flimmer- oder Zylinderepithel) kann man die Ver- teilung des Epithels von der Oberfläche aus mit der Lupe nach folgender Methode von Zilliacus beurteilen: Man schneidet die Organe, wie Kehlkopf, Uterus usw., auf, -fixiert sie nach sorgfältigem Reinigen in physiologischer Kochsalzlösung in natürlicher Lage 24 Stunden in: gesät- tigter Pikrinsäurelösung 1 Vol., gesättigter Sublimatlösung 1 Vol. und dest. Wasser 2 Vol. ; aus diesem Gemisch ge- nommen, werden die Stücke 1 Stunde in fließendem Wasser gewaschen und auf 2 — 3 Tage in eine gesättigte wässerige Pikrinsäurelösung übertragen. Nach Abspülung des Prä- parates in gewöhnlichem Wasser wird es wenige Minuten (2') in P. Mayerschem Hämalaun unter Kontrolle ge- färbt. Zum Schluß spüle man, wenn nötig, mit l%iger Sodalösung, dann was^che man usw. Das Plattenepithel er- scheint gelb, das zylindrische grünschwarz. 170 Untersuchung des Blutes. § 676—679. 15. Kapitel. Die Untersuchung des Blutes. 1. Die Blutentnahme. 676. Zur Blutentnahme benötigt man ein kleines, spitzes Messerchen, ev. eine Impflanzette. Noch einfacher ist es, eine Stahlschreibfeder zu nehmen, deren eine Spitzen- hälfte abgebrochen ist (Pappenheim). Viel gebraucht, doch entbehrlich ist der Franckesche Schnepper. Man macht damit in die festgehaltene, durch leichte Stauung hyper- ämisch gemachte Fingerkuppe (oder in das Ohrläppchen) einen raschen, 2 — 3 mm tiefen Einstich. Sehr wichtig ist es, die betreffende Hautstelle vorher durch Waschen mit Seife und Abreiben mit Alkohol gründlich zu entfetten. Der erste herausquellende Blutstropfen wird abgewischt. Für jedes Präparat muß wieder ein frisch heraustretender Bluttropfen verwendet werden, während der Überrest des vorhergehenden Tropfens abgeputzt wird. 677. Objektträger wie Deckgläser müssen peinlich fettfrei gemacht werden (vgl. § 37 a, § 777). Man reibt sie zuletzt noch mit Ätheralkohol ab und zieht sie einige Male durch die Flamme. 678. Bei höheren Wirbeltieren (Kaninchen, Meer- schweinchen usw.) gewinnt man das Blut durch Anstechen einer Ohrvene, die man durch Anlegen einer einfachen Ligatur um die Ohrwurzel anschwellen läßt. Bei kleinen Tieren, Embryonen, Amphibienlarven usw. punktiert man das Herz mit einer feinen Glaskanüle, oder man nimmt das Herz heraus, wobei man mit einer Pinzette die Herz- basis abklemmt, schneidet die Herzspitze ab und verwendet das austretende Blut zum Ausstrich. Bei Mäusen gewinnt man das Blut ohne weitere Schädigung durch Abschneiden eines Schwanzstückes, bei Fischen durch Abschneiden von Flossen. 2. Untersuchung des frischen Präparates. a) Rote Blutkörperchen. 679. Die roten Blutkörperchen können ohne weiteren Zusatz untersucht werden. Man tupft mit einem Deck- gläschen die Kuppe eines Bluttropfens ab, legt es rasch auf einen Objektträger und umrandet mit einem in ge- schmolzenes Paraffin oder Wachs getauchten Pinsel, um einem Verdunsten der Blutflüssigkeit vorzubeugen. Hat man nicht genügend rasch verfahren, so treten mehr oder weniger starke Veränderungen ein (Stechapfel- oder Morgensternform, Keulenform). § 680 — 683. Untersuchung des Blutes. 171 680. Vermischt man den Bluttropfen mit etwas dest. Wasser, so blähen sich die Erythrozyten zunächst auf und geben dann ihren Farbstoff (Hämoglobin) ab. Sie werden dadurch immer blaßer und entziehen sich mehr und mehr der Beobachtung (Schatten). Setzt man dann eine 5% ige Lösung von Kai. chloric. zu, so schrumpfen sie stark zu- sammen und nehmen wieder Hämoglobin auf. Man ver- gesse nicht, auch Galle desselben Tieres zuzusetzen, nament- lich weil man dabei eine direkte Lösung der Blutkörperchen beobachten kann : sie blähen sich auf und explodieren förm- lich. Ähnlich wirkt Kochsalz (hypotonisch) oder schwefel- saures Natrium. Bei Zusatz verdünnter (z. B. 5%iger) Essig- säure blähen sie sich im Augenblick der Berührung stark auf, werden zunächst etwas dunkler, um dann rasch den Farbstoff abzugeben. Man benützt dies bei Zählungen der weißen Blutzellen, da die roten Blutkörperchen dabei un- sichtbar werden, während die weißen um so deutlicher hervortreten. 681. Die Oberflächenschicht der Erythrozyten ist für Kochsalzlösung nicht durchgängig (daher Schrumpfung), wohl aber für Harnstoff. Die Erythrozyten sind weiter imperme- abel für Natrium-, Kalium-, Baryum-, Strontium- etc. -Salze, ferner für Dextrose und Inosit. Permeabel sind sie für Am- moniumchlorid, Ammoniumazetat, Ammoniumoxalat, Methyl- und Äthylalkohol, Glyzerin, Azetamid, Biuret, Pyridin (Cohn- stein 96). 682. Um den Randfaden von Amphibienery- throzyten (Salamandra atra oder maculosa) zu zeigen, setzt man zu einem frischen Bluttropfen etwas Gentiana- oder Methylviolett-Kochsalzlösung (0,25 g Farbstoff gelöst in 100 ccm einer 6,6% igen NaCl-Lösung) (Meves). 683. Bei einer von Arnold angegebenen Methode werden die Blutkörperchen gegen Austrocknung und mecha- nische Verletzung geschützt. Man sterilisiert dazu ganz dünne, mit dem Mikrotom geschnittene Scheibchen von getrocknetem Hollundermark durch Kochen in dest. Wasser und trocknet sie. Zur Untersuchung legt man ein derartiges Plättchen auf ein steriles Deckglas, beschickt es mit einem Bluttropfen und legt das Ganze mit dem Tropfen nach unten auf einen mit Vaseline umrandeten, hohlgeschlif- fenen Objektträger. Will man den Einfluß von Salzlösungen, Farbstoffen u. dgl. verfolgen, so befeuchtet man das Holun- derblättchen vorher mit der betreffenden Flüssigkeit. Man kann schließlich auch das Ganze fixieren, einbetten usw. 172 Untersuchung des Blutes. § 684—689. 684. Als indifferente Beobachtungsflüssigkeit zum Ver- dünnen des Blutes ist am besten Blutserum des gleichen Tieres. Weniger indifferent sind die in § 48 — 50 genannten Flüssigkeiten. Die Hayemsche Flüssigkeit (Sublimat 0,5 g -)- Kochsalz 1,5 g + schwefelsaures Natron 5 g -|- Wasser 200 ccm) vollends wirkt natürlich auch fixierend. b) Weiße Blutzellen. 685. Die oben gegebenen Methoden gelten auch für weiße BlutzeJlen. Will man an ihnen Lebensäußerungen, wie amöboide Bewegungen usw. beobachten, so bedarf man bei Warmblütern eines heizbaren Objekttisches oder Mikroskopschrankes (s. § 85). Kaltblüterblut kann man dagegen bei Zimmertemperatur untersuchen. Man benützt dabei Objektträger und Deckgläser aus Quarz oder man überzieht nach Deetjen die Objektträgerfläche mit einer dünnen wSchicht einer Agarlösung (s. § 687), worauf man den Bluttropfen und ein Deckglas aufsetzt und mit Wachs umrandet. 686. Um weiße Blutzellen zu gewinnen, bringt man sterile Holunderblättchen (s. § 684) in den Rückenlymph- sack eines Frosches und vernäht die Wunde. Nach wenigen Stunden findet man sie voll von Leukozyten. Weitere Technik wie § 684. 687. Zur Herstellung der Agarlösung löst man 1 g pulv. Agar durch Kochen in 100 ccm Wasser, filtriert heiß und setzt zu 100 ccm Filtrat 0,6—0,9 g NaCl. Füllt man die Lösung in sterile, mit Wattebausch versehene Reagens- röhrchen ab, so läßt sie sich 3 — 4 Wochen lang aufbewahren. Zum Gebrauch verflüssigt man das Agar durch Einstellen in kochendes Wasser. 688. Um die feinsten Protoplasmaausläufer zu sehen, arbeite man mit Dunkelfeldbeleuchtung (ein besonders günstigos Objekt sind die Hämolymphzellen des Fluß- krebses). c) Blutplättchen. 689. Die Blutplättchen verändern sich außerordent- lich leicht; um sie zu untersuchen, bringt man einen Tropfen einer l%igen Osmiumsäure auf die vorher gut gereinigte Haut und sticht dann unter dem Tropfen ein, so daß sich das Blut mit der Flüssigkeit mischt ohne vorher mit der Luft in Berührung zu kommen. Dann Abnehmen des Trop- fens mit dem Deckglas usw. § 690—693. Untersuchung des Blutes. 173 690. Als Auffangflüssigkeit kann man auch 0,6- bis 0,9% ige Kochsalzlösung mit etwas Methylviolett (500: 0,1) oder die Hayemsche Flüssigkeit (s. § 684) verwenden. 691. Um Blutplättchen in Menge zu gewin- nen, läßt man nach Bürker einen großen Bluttropfen auf einen in Paraffin getauchten und hierauf wieder erkal- ,teten Objektträger fallen und stellt ihn in einer mit an- gefeuchtetem Filtrierpapier ausgelegten Petrischale für 20 bis 30 Minuten in den Brutschrank. Der Tropfen gerinnt dabei nicht, die Blutkörperchen sinken zu Boden, während die spezifisch leichteren Blutplättchen sich oben sammeln und bei Betupfen der Tropfenkuppe mit einem Deckgläs- chen an diesem massenhaft kleben bleiben. 3. Herstellung des Ausstridipräparates. 692. Die Ausstrichpräparate stellt man entweder auf Deckgläschen oder auf Objektträgern her. Bei Herstellung eines Deckglaspräparates bringt man einen kleinen Blut- tropfen auf die Mitte eines Deckgläschens, läßt ein zweites in der in Fig. 6 gezeichneten Weise, also überkreuzt, darauf- fallen, und zieht sie kurz darauf unter Vermeidung jeg- lichen Druckes wieder auseinander. Die Deckgläschen hält man dabei an je einer Ecke mit den Fingerspitzen fest. Fig. 6. Fig. 7. 693. Bei Objektträgerpräparaten tupft man einen Blut- tropfen mit der in der Fig. 7 mit X bezeichneten Stelle des Objektträgers A ab, setzt einen zweiten Objektträger B in der gezeichneten Weise derart auf, daß sich der Blut- tropfen in dem Winkel a ausbreitet und schiebt nun den Objektträger B in der Richtung des Pfeiles (nicht um- gekehrt!!) über den Objektträger A hinweg, wobei man den Bluttropf^n in dünner Schicht über den ganzen Objekt- träger ausbreitet. (Der zum Ausziehen des Tropfens be- nützte Objektträger B besitzt am besten geschliffene Kanten; unbedingt nötig ist es jedoch nicht.) 174 Untersuchung des Blutes. § 694 — 699. 694. In beiden Fällen müssen die Blutkörperchen schließlich in ganz dünner Schicht und eines mög- lichst isoliert vom andern über die Glasfläche aus- gebreitet sein. Nach dem Ausstreichen läßt man sie, ev. unter Hin- und Herbewegen, möglichst rasch lufttrocken werden. 695. Bei gewissen Methoden werden die Ausstriche dagegen noch vor dem Lufttrockenwerden weiterbehandelt. Vgl. § 705. 4. Fixierung der Ausstrichpräparate. a) Fixierung des lufttrockenen Ausstriches. 696. Am besten (besonders für Giemsafärbung) stellt man die lufttrockenen Ausstriche für 10 Minuten in abs. Methylalkohol, trocknet sie mit Filtrierpapier ab und läßt sie wieder lufttrocken werden. Bei May- Grünwald- präparaten ist eine Fixierung unnötig, da diese durch den in der Farbe enthaltenen Methylalkohol besorgt wird. 697. Statt in Methylalkohol (nach Nikiforoff auch statt § 698) kann man 1 — 2 Stunden in Äthylalkohol- Äther (ää und wasserfrei) fixieren. Auch Azeton kann man verwenden (5 Minuten). Nach der Fixierung läßt man wieder lufttrocken werden. 698. Für einzelne Färbungen (z. B. Triazidfärbung) wird der Ausstrich durch Hitze fixiert (Ehrlich). Man erhitzt dazu eine Kupferplatte durch eine darunter ge- stellte Bunsenflamme so stark, daß ein aufgetropfter Wasser- tropfen das Leidenfrostsche Phänomen zeigt. (Hin- und Herrollen in Kugelform.) An diese Stelle legt man das lufttrockene Deckglas für 5 — 30 Sekunden (meist genügen 7 — 10 Sekunden) mit der Schichtseite nach unten auf. Die Dauer der Einwirkung ist von großem Einfluß auf die Güte der Färbung (es handelt sich dabei oft nur um Sekunden). Bei zu langer Einwirkung der Hitze bekommen die Granula zackige Form. b) F i x i e rVn gdesfeuchtenAusstrichpräparates. 699. Gute Ergebnisse liefert die Osmiumräucherung nach Weidenreich, durch die besonders auch die Blut- plättchen gut fixiert werden. Die gereinigten Objektträger werden für 1 — 2 Minuten über eine Glasschale gelegt, in die man 5 ccm einer 1% igen Osmiumsäure und 8 bis 10 Tropfen Eisessig gegeben hat. Das Ganze überdeckt man mit einer Glasglocke. Dann streicht man einen fri- § 700—703. Untersuchung des Blutes. 175 sehen Bluttropfen auf der geräucherten Glasseite des Objekt- trägers aus und setzt die noch feuchte Blutschicht noch- mals höchstens 1 Minute den Dämpfen aus. (Längere Ein- wirkung beeinträchtigt die Färbbarkeit.) Hierauf zieht man ihn 5 mal durch eine Flamme. Vor der Färbung stellt man ihn 1 Minute in eine hellrote Lösung von übermangan- saurem Kali, wäscht ab und färbt (besonders mit Giemsa- lösung s. § 717). 700. Die Räucherung kann man auch in einem mit ein- geschhffenem Glasstöpsel versehenen Glastubus vornehmen, an dessen Boden man etwas mit der Flüssigkeit befeuchtete Glaswolle geschoben hat. 701. Statt mit Osmiumdämpfen kann man auch mit Formoldämpfen fixieren, was besonders für Amphibienblut vorzuziehen ist (Weidenreich). 702. Die Blutzellen niederer Wirbeltiere fixiert man am besten nach Werzberg: Die lufttrockenen Aus- striche werden am folgenden Tag 1 — 2 Minuten durch die Dämpfe von folgendem Gemisch fixiert: 3 ccm Jodtinktur -|- 1 ccm Formalin + 10 Tropfen einer 2% igen Osmiiim- säurelösung und Eisessig ää. Nach einem weiteren Tag wird gefärbt. Färbt man zu früh, so treten Farbinver- sionen auf. Zur Darstellung sehr zarter Elemente, z. B. von Spindelzellen, fixiert man die Ausstriche, solange sie noch feucht sind. 703. Um die Form der weißen Blutzellen, die bei gewöhnlichen Ausstrichen sehr oft beschädigt wird, gut zu erhalten, empfiehlt sich folgende Methode Weidenreichs: Zunächst gießt man eine nach § 687 bereitete und durch Einstellen in kochendes Wasser verflüssigte Agarlösung in nicht zu dünner Schicht auf einer reinen horizontal stehenden Glasplatte aus. Nach Erstarren (nicht Trocknen!) schneidet man vierseitige Plättchen aus, die kleiner als das später zu benützende Deckglas sind. Mehrere derselben bringt man ^. dann in Abständen auf eine Glasplatte. Dann tupft man mit einem sorgfältig gereinigten, durch die Flamme gezogenen Deckglas einen nicht zu großen Bluttropfen ab und legt ihn ohne Druck und Schub auf das Agarplättchen auf. Nach 5 — 10 Minuten, während welcher man, falls man Bewegungs- studien machen will, die Glasplatte in den Brutofen stellt (37° G), gibt man, ohne das Deckglas zu berühren, einige Tropfen einer l%igen Osmiumsäure von der Seite her unter das Deckglas, so daß der freigebhebene Rand zwischen Glas und Agar völhg ausgefüllt wird. Nach etwa 5 Minuten hebt man das Deckgläschen vom Agar ab, spült mit Wasser ab und färbt die an ihm haftengebhebene Blutschicht (am besten nach Giemsa). 176 Untersuchung des Blutes. § 704 — 709. 704. Bei der Färbung der fixierten feuchten Aus- striche fallen die Farbtöne häufig etwas anders aus, als bei typisch vorbehandelten lufttrockenen Ausstrichen. 705. Eine weitere Methode ist, die noch feuchten Ausstriche (besonders von Organen wie Milz, Knochen- mark) für kurze Zeit (ca. 10 Minuten in eine der bekannten Fixierungsflüssigkeiten (hier besonders nach Helly, Maxi- mow und Orth, oder in Sublimat) einzustellen. Dann wird gut ausgewaschen und ohne vorheriges Trocknen ge- färbt. Oft ist es gut, die Präparate vor dem Färben noch in 80 — 90% igen Alkohol zu bringen (ev. auch SubUmat- entfernung nach § 175 u. 176). 5. Die Färbung des Ausstridipräparates. 706. Praktisch am wichtigsten ist die Fär- bung nach May-Grünwald (oder Jenner), Giemsa und besonders die Kombination beider Färbungen nach Pappenheim. Allgemeine Bemerkungen zur Ausführung der Färbung. 707. Die Blutfärbungen werden bei Objektträgeraus- strichen in der Regel so vorgenommen, daß der flach in einer Petrischale hegende Objektträger mit der Farblösung in 1 — 2 mm hoher Schicht überschichtet wird, wobei man sorgfältig ein Herabfheßen der Flüssigkeit über die Ränder des Objektträgers vermeidet. Färbt man mehrere Präpa- rate zugleich, so färbt man am besten im Färbetrog nach M. Mayer (s. Lautenschläger, Katalog 100 Nr. 5882). Das Einschheßen in eine Petrischale usw. ist nötig, um ein Ver- dunsten und eine dadurch eintretende Farbstoffausfällung zu vermeiden. 708. Deckglaspräparate legt man mit der Schichtseite nach abwärts in ein Uhrgläschen oder Blockschälchen und unterschichtet mit Farblösung, bis die Flüssigkeit die Unter- fläche des Deckgläschens benetzt. Man kann sie auch einfach auf der Flüssigkeit schwimmen lassen. 709. Das zum Verdünnen der Farblösungen und Aus- waschen der Präparate benutzte dest. Wasser muß abso- lut rein und säurefrei sein. Das dest. Wasser darf bei Silbernitratzusatz keine Opaleszenz, bei Phenolphtha- leinzusatz keine Rotfärbung zeigen. Für manche Fär- bungen (z. B. Giemsa, s. § 710) ist ein ganz geringer Al- kaleszenzgrad vorteilhaft. § 710 — 714. Untersuchung des Blutes. 177 710. Giemsa prüft das zur Herstellung reiner Farblösung verwendete dest. Wasser, indem er in 10 ccm davon einige Tropfen einer frisch bereiteten Lösung von einigen Körn- chen Hämatoxylin in abs. Alkohol gibt. Es soll sich in fünf Minuten, nicht aber vor Ablauf 1 Minute, schwach aber deutlich violett färben. Bleibt es farblos, so setzt man dem Wasservorrat solange tropfenweise l%ige Natriumkar- bonatlösung zu, bis die Reaktion in einer neuen Probe in der angegebenen Weise erfolgt. 711. Zum Abmessen der Mengen beim Verdünnen der Farblösungen benötigt man dringend graduierte Glaspipetten von 1 ccm Inhalt; denn nur dann lassen sich annähernd gleichgroße Tropfen erhalten. Am besten hält man sich überhaupt an exakte Maßzahlen, da sich die Tropfengröße natürlich auch je nach der Größe der Ausflußöffnung ändert. Absolut zu verwerfen ist das zwar häufig geübte, aber sehr ungenaue und unsaubere direkte Heraustropfen der Lösung aus der Flasche. 712. Die Pipetten müssen nach Gebrauch gleich wieder mit dest. Wasser, 96%igem Alkohol und dest. Wasser mehr- mals ausgespritzt werden. Mißt man die Farblösung im Meßzylinder ab, so stellt man die Verdünnung nicht durch Nachgießen von dest. Wasser in den gleichen Zylinder her, sondern schüttet die in getrennten Zylindern abgemessenen Mengen in ein gesondertes Gefäß zusammen. Dazu benützt man keine engen Reagensröhrchen, sondern etwa 2 — 3 cm weite Glaszyhnder (z. B. Färbegläser wie Fig. 4, S. 80). Die Lösung wird rasch in das dest. Wasser geträufelt und der Zylinder herumgeschwenkt, bis beide Flüssigkeiten homogen durchmischt sind, nicht länger, da sonst der Farbstoff leicht ausgefällt wird. 713. Nach der Färbung werden die Präparate meist mit Filtrierpapiei^ abgetrocknet; sind sie dann nach einigen Minuten lufttrocken, dann bedeckt man sie zur Untersuchung entweder gleich direkt mit einem Tropfen Immersionsöl, das man nach Beendigung gleich wieder mit einem weichen Leinen und etwas Toluol wegwischt, oder man tropft Kanadabalsam auf und bedeckt mit einem Deckglas. Der zum Eindecken benutzte Kanadabalsam muß neutral sein, da sonst die Färbungen rasch verblassen. Hat man keinen solchen zur Verfügung, so ist es besser, die Präparate uneingedeckt aufzuheben. Spezielle Methoden. 714. Färbung nach May- Grünwald oder Jenner mit eosinsaurem Methylenblau: 1. Die frisch hergestellten, luft- trockenen Ausstriche kommen zur Fixierung für 3 Minuten Romeis, Taschenb. d. mikrosk. Technik. 8. Aufl. 12 178 Untersuchung des Blutes. § 715 — 747. in die unverdünnte Farblösung. 2. Zusatz der gleichen Menge dest. Wasser und Fortsetzung der Färbung für 5 bis 15 Minuten. Erst in dieser Lösung findet die eigentliche Färbung statt; das Präparat muß darin einen rötlichen Ton annehmen. 3. Abgießen der Lösung, ganz kurzes Ein- tauchen in dest. Wasser. Trocknen zwischen Filtrierpapier. Resultat: Kerne blau, eosinophile (a-) Granula leuchtend ziegelrot, basophile ()'-) Granula tiefblau, neutro- phile («-) Granula: feine hellrote bis purpurrote Körnchen. Blutplättchen: blaßblau; Erythrozyten: hellrot. Die Färbung gelingt am besten mit ganz frisch her- gestellten Ausstrichen. Ältere fixiert man etwa % Stunde mit Methylalkohol oder einige Stunden mit Äther-Alkohol. 715. Der bei dieser Methode wirkende Farbstoff stellt eine in Methylalkohol gesättigt gelöste, leicht dissoziierbare che- mische Verbindung des eosinsauren Methylenblaus dar, die bei Mischung einer l^/f^igen Lösung von Eosin und iVooi^Gn Lösung von Methylenblau medic. entsteht. Von einer Selbst- herstellung des Farbstoffes ist jedoch abzusehen, man bezieht ihn am besten von Grübler. Vorteilhaft hält man sich die Farbe in Tablettenform vorrätig und löst kurz vor Gebrauch eine fein zerriebene Tablette in 10 com reinsten Methyl- alkohol. 716. Aß mann modifiziert die Färbung wie folgt: 1. Auf- tropfen von 40 Tropfen der Farblösung auf den frisch her- gestellten, unfixierten, in einer Petrischale liegenden Objekt- trägerausstrich 1/2 Minute. 2, Übergießen mit 20 ccm dest. Wassers, dem 5 Tropfen einer Kahumkarbonatlösung (Pott- asche) 1 : 1000 zugesetzt wurden. 1 Minute. 3. Kurz Ein- tauchen in dest. Wasser, Abtrocknen. 717. Färbung nach Giemsa (Romanowsky): 1. Fi- xieren des frischen, lufttrockenen Präparates in Methyl- alkohol 3 Minuten (wenn älter 2 Minuten) oder in abs. Alkohol oder Äther-Alkohol 20 Minuten. 2. Färben in einer frisch hergestellten Verdünnung (s. u.) der Giemsa- Lösung, 15 Minuten oder länger. 3. Gründliches Wässern in fließendem Wasser (5 Minuten). 4. Abtrocknen mit Fließpapier (nicht durch Erwärmen, da dadurch die Azur- granula zerstört werden). 5. Einschluß in Kanadabalsam oder Zedernöl. Resultat: Kerne violettblau; eosinophile Granula rot; neutrophile: rotviolett; basophile: blau bis blauviolett; Protoplasma der Lymphozyten blau, ev. mit feinen purpur- roten Granula: Azurkörnchen, Erythrozyten rötlich. Kerne von Protozoen leuchtend rot, Blutplättchen blau mit vio- lettrotem Innenkörper. § 718 — 722. Untersuchung des Blutes. 179 718. Die Verdünnung der Farblösung erfolgt in der Weise, daß man 15 Tropfen = 0,3 ccm Stammlösung (neue Vorschrift) mit 10 ccm dest. Wassers verdünnt (vgl. auch § 711 f.) Bei der Lösung nach alter Vorschrift werden 10 Tropfen = 0,2 ccm mit 10 ccm dest. Wasser verdünnt. Fällt der Farbstoff kurz nach der Herstellung der Ver- dünnung aus, so ist die Lösung unbrauchbar. 719. Die Giemsalösung enthält Methylenazur, Methylen- blau und Eosin. Man bezieht sie am besten gebrauchsfertig von Grübler. Der zusammengesetzte Farbstoff ist bei Grübler auch trocken in Kapseln erhältlich. Zur Lösung schüttet man den Inhalt einer Kapsel (für 100 ccm Stammlösung) in einen reinen Glaskolben, der 80 ccm Methylalkohol (puriss. Kahlbaum I) und 20 ccm Glyzerin (puriss. Merck) enthält und erwärmt den Kolben unter öfterem Umschütteln im Wasserbad (oder Thermostat) auf 60" C. Nach dem Erkalten wird durch ein trockenes Filter in eine reine trockene, gut verschheßbare Flasche filtriert. 720. Ausgezeichnete Resultate gibt die von Pappenheim empfohlene Kombination der May-Grün- wald- und Griemsa-Methode (Panoptische Färbung): L Fixieren des frischen lufttrockenen Ausstriches durch darüber geschichtete May- Grünwald-Lösung 3 Mi- nuten. 2. Zufügen der gleichen Menge dest. Wassers 1 Mi- nute. 3. Abgießen, nicht Abspülen der verdünnten Farb- lösung und Zufügen der verdünnten Giemsa-Lösung (15 Tr. = 0,3 ccm auf 10 ccm dest. Wassers). Färbung 12 — 15 Mi- nuten. 4. Kräftiges Abspülen in dest. Wasser, Trocknen zwischen Filtrierpapier. 5. Einlegen in neutralem Balsam. Resultat: Kerne rötlichviolett, Plasma der lympho- iden Zellen lichtblau; lymphoide Azurkörnung leuchtend purpurrot, myeloische Azurkörnung violett mit einem Stich ins Violettbräunliche, Neutralkörnung: bräunlich bis bläu- lichrosa, eosinophile: bräunlichorange bis ziegelrot; Mast- körnung: ultramarin mit Stich ins Violette. Polychrome Fi3rmen der Erythrozyten überwiegend bläulich, basophile Punktierung der Erythrozyten: kräftig kobaltblau. 721. Ganz ähnlich ist die Ausführung der von Pappen- heim (11) angegebenen Färbung mit »Panehrom«, nur färbt man bei Nr. 3 statt mit verdünnter Giemsalösung 15 Mi- nuten mit verdünnter Panchromlösung (15 Tropfen = 0,3 ccm) auf 10 ccm dest. Wasser). Über Schnittfäi'bung mit panop- tischem Gemisch und Panehrom s. § 446 u. 448. 722. Sehr gute Resultate gibt auch die Färbung nach Kardos-Pappenheim. Nr. 1 u. 2 wie in § 720, dann 3. Ab- 12* 180 Untersuchung des Blutes. § 723—725. gießen der Farblösung und Färben mit fertiger käuflicher Pappenheim-Kardoslösung (Grübler) 15 Minuten. Kurzes Abspülen in Wasser, Trocknen, Einbetten. Bei Schnitt- färbung färbt man die nach Orth oder Helly fixierten, paraffinbefreiten Schnitte 1 — 2 Stunden bei 37^ zugedeckt in der Pappenheim-Kardoslösung, spült dann in dest. Wasser ab und trocknet mit Fließpapier ab, entwässert kurz in abs. Alkohol, dann Xylol und Balsam, Resultat: Die Färbung gibt ausgezeichnete Diffe- renzierung zwischen Mastzellen, Eosinophilen, Lympho- zyten, Bindegewebszellen und Bindegewebe. Die Kerne sind violettrot. Azurkörnung der lymphoiden Zellen: pur- purrot; neutrophile Körnung bräunhchviolett, und zwar kräftiger und distinkter als sonst bei Giemsa ; das Paraplasma der fertig differenzierten polynukleären Neutrophilen diffus rosa. Paraplasma der Lymphozyten, Monozyten und Leuko- blasten hellblau, Spongioplasma scharfblau strukturiert. 723. Mitunter entsteht Azurpräzipitation durch Farb- stoffniederschlag, die mit echter Azurgranulation verwechselt werden könnte. Taucht man die völlig trockenen Präpa- rate vor dem Eindecken erst noch kurz in abs. Alkohol, so löst sich die erstere. 724. Die von Kardos angegebene länger haltbare Farb- mischung (nach Pappenheim- Kardos) besteht aus verdünnter Giemsalösung und einer Methylgrün-Orangelösung, und zwar: 10 Tropfen G.-L. = 0,14 ccm + 5 Tropfen M.-O. = 0,10 ccm + 15 ccm Wasser. Nach der Mischung muß die Lösung kräftig umgeschüttelt und vom malvefarbigen Schaum abgegossen werden. Die Methylgrün-Orangelösung wird so hergestellt, daß das Präzipitat, das bei Vereinigung einer 2% igen wässe- rigen Orange- G-Lösung mit konz. wässeriger Methylgrünlösung entsteht, auf dem Filter gesammelt, getrocknet und in Methyl- alkohol aufgenommen wird (als Methylgrün-Orangelösung nach Pappenheim, ebenso wie die fertige Kardosmischung bei Grüb- ler erhältlich). Außer diesen vielseitigen, allgemein orien- tierenden Methoden seien zur Darstellung spe- zieller Strukturen noch folgende angeführt: 725. Zur Trennung von a- und /i?- Granulationen (in eosinophilen und pseudoeosinophilen Leukozyten), welch letztere besonders in Blutzellen von Kaninchen und Meer- schweinchen vorkommen (vgl. u. a. Furno 11, Benacchio 11), färbt man die hitzefixierten Ausstriche mit dem Ehr- lich sehen Triglyzeringemisch: Eosin 2 g, InduHn 2 g, Aurantia 2 g, Glyzerin 30 ccm. Dasselbe wird vor der Färbung auf 60^ C erwärmt, dann wird 24 Stunden bei § 726 — 732. "^ Untersuchung des Blutes. 181 37° C gefärbt, mit Wasser abgespült und getrocknet. Re- sultat: Kerne schwarz, eosinophile (a-) Granula gelb, Spe- zial-(/i-) Granula dunkelrot, basophile Granula dunkelgrau- schwarz. 726. Die }- Granulationen (Mastzellen) lösen sich leicht in Wasser, nicht in starkem Alkohol. Man färbt sie nach Ehrhch mit einer gesättigten Lösung von Dahlia in: Eis- essig 12,5 + abs. Alkohol 50,0 + dest. Wasser 100,0. Zur Darstellung in Schnitten wird das Objekt mindestens 24 Stunden in abs. Alkohol fixiert. 727. Über die Färbung in Schnitten sowie Unterscheidung von Plasmazellen s. § 744. 728. Zur Darstellung der ()- Granulationen (sehr feine basophile Granulationen in Monozyten) färbt man 10 bis 20 Minuten in gesättigter wässeriger Methylenblaulösung. Abspülen in Wasser. Trocknen. Ebenso zum Nachweis basophiler Punktierungen der Erythrozyten. 729. Die £- Granulationen (neutrophile Leukozyten) lassen sich am besten mit dem Triazidgemisch von Ehr- lich-Biondi darstellen. Man fixiert am besten in der Hitze (§ 698) und färbt mit der von Grübler zu beziehenden oder nach § 436 hergestellten Farblösung, indem man sie mit einer Pipette auf den Ausstrich schichtet. Nach 5 bis 10 Minuten Abspülen mit dest. Wasser, bis keine Farb- wolken mehr abgehen. Trocknen zwischen Filtrierpapier. Resultat: Kerne grün (meist unscharf), eosinophile Granula: leuchtend kupferrot, neutrophile: violettrot; basophile ungefärbt, ebenso Protoplasma der Lympho- zyten. Erythrozyten orange. 730. Ein von Pappenheim angegebenes Triazid (02) enthält noch Methylenblau zur besseren Kernfärbung. An- wendung wie vorausgehend. 731. Um die Piastosomen (Mitochondrien) in Aus- strichpräparaten dai^zustellen, fixiert Schridde dünne, -feuchte Ausstriche in Orthschem Gemisch (1 — 2 Stunden), spült mit dest. Wasser ab und legt 30 Minuten in 0,5% ige Osmiumsäure. Dann kurz abspülen, färben und differen- zieren nach Altmann, s. § 537. Noch besser gehngen die Methoden nach Benda, Meves, Regaud oder Kiyono auf feuchte Ausstriche angewandt. 732. Zur Unterscheidung von Spongioplasma und Para- plasma, ferner von Lymphozyten und Spindelzellen niederer Tiere wendet Pappenheim (10) eine Kombination der Farb- lösungen von Unna und Ziehl an (s. auch Werzberg 11). Fixation: Hitze (7 — 10 Sekunden) oder Dampfgemisch nach 182 Untersuchung des Blutes. § 733—736. § 702, sodann abs. Alkohol + Methylalkohol ää (ca. 15 Mi- nuten). Zur Färbung gibt man auf 10 ccm dest. Wasser 8 bis 10 Tropfen polychromes Methylenblau-Unna (s. § 744) und 8 Tropfen Karbolfuchsin. Färbedauer 5 — 8 Minuten. Häu- figes Abspülen in dest. Wasser. Trocknen. Einbetten. Resultat: Kerne blau, alle Plasmas, auch Spindelzellen, rot, nur Lymphozyten und Großlymphozyten infolge ihres hohen Spongioplasmagehaltes blau. 733. Herstellung von Karbolfuchsin: Fuchsin 1 g, abs. Alkohol 10 ccm, 5%iges Kai'bolwasser 100 ccm. 734. Aus einer Mischung von Pikiunsäure und einem an- deren sauren Farbstoff färben sich die Erythrozyten beson- ders mit Pikrinsäure. Zur Sichtbarmachung des Hämoglobins in blutbildenden Zellen dient Eosin. 735. In nachfolgender Tabelle sind die häufigsten Methoden übersichtlich zusammengestellt. Die bei Anwendung derselben besonders deutlich hervortretenden Zellbestandteile sind durch Fettdruck hervorgehoben. B. Herstellung von Schnittpräparaten. 736. Zur Fixierung von Organstückchen und Em- bryonen eignet sich bei hämatologischen Untersuchungen besonders das Orthsche Gemisch (90 ccm Müllersche Flüs- sigkeit -|- 10 ccm Formol) und die Zenkersche Flüssigkeit, nur daß man bei der letzteren auf 100 ccm Flüssigkeit statt Eisessig nach der Modifikation von Helly-Maximow 10 ccm Formol zusetzt. Der Formolzusatz darf erst un- mittelbar vor Gebrauch der Lösung erfolgen. Zur Fixie- rung von Warmblütergewebe empfiehlt Maximow (09) die Fixierungsflüssigkeit auf 37^ C zu erwärmen, dann Formol zuzugeben und die frischen lebenswarmen Objekte rasch in die Lösung zu bringen. Nach einer halben Stunde läßt man die Lösung wieder abkühlen. Dünne Keimscheiben präpariert man vorher in körperwarmer Ringerlösung mit Schere und Pinsel vorsichtig ab, schiebt sie auf die Kon- vexität eines Uhrglases und bringt sie durch Aufträufeln von etwas Fixierungsflüssigkeit während ein paar Sekunden in aufgespannter, faltenloser Lage zur Erstarrung. Dann werden sie in der Fixierungsflüssigkeit durch leichtes Schwenken des Glases von demselben losgelöst. Die Organ- stückchen dürfen nicht zu groß sein. Bei Embryonen über 1,5 cm Länge muß die Hautdecke geöffnet werden. Dauer der Fixierung bei Keimscheiben u. dgl. 10 — 15 Minuten, Embryonen bis zu 3 mm 1 Stunde, größer bis zu 6 Stunden. Sodann 24 stündiges Auswaschen in fheßendem Wasser, § 735. Untersuchung des Blutes. 183 Trombo- zyten 3 blau mit rotviol. innen- s a kl Ol 3 © ö TT ® ( ca S kör blau ro viole Inn :4 2 e a UM :© 1 1 1 1« o u o OB © 9 SC i 1 baso- hlle unk- 61) a 3 kl » d o o o u © 9 O 3 3 a -N d C3 5 1 Co 12 1 M 2 « Ä u 2a '> • •Gran, ingran asoph, Zellen §3 iolett- blau t^3 .2« 3 Co Q 1 Q schar grau CM *C «-Q-' •o > > > 3 CÄ^ 1 ■ i • «-I d s 9.« •w S > .23 > ® "© 3 5 I « a 5 /5-Gran. Spezial- zellen leuch- tend ziegelrot 4^ 2 o kl O kl kräftig rot • fl kl 3 1 ik-i 1 O .*« -*a .^ . 1 .^ .e 1 S P<4) 2 o ® © o ® S o kl 1 «3 J N «,M 3 Kl 3 3 ^« scharf rot- violett ä « ® ä 1 :3 G 4.H kl er! schwär bis gra 3 cö ca s ^5 > 99 > ä5^ CO .— ^ rs o es Me- ü (May Jenner 4 ärbung 7 Panoptisches Ge- misch nach Pappen- heim und ganz CA CO T3 •F— 1 e CÜ o 1— 1 ä o o in s Ü cd C cd n nach 5 3 in 0) s osinsaur lylenblai ünwald, §71 iemsa-F §71 ähnlich ichrom- o 1 CA! o cS Ü riglyceri §72 O OOQ W £-• 184 Untersuchung des Blutes. § 737 — 741. Jodbehandlung zur Entfernung des Sublinnats nach § 174. Einbettung in Zelloidin oder Zelloidinparaffin. 737. Sehr gute Resultate gibt auch die von Maximow angegebene Flüssigkeit (Zenkersche Flüssigkeit mit Zusatz von Formol-Osmiumsäure s. § 186). 738. Das Hämoglobin wird durch die angeführten Flüssigkeiten in den Blutzellen gut fixiert. Auch Sublimat- Kochsalzlösung (nicht Sublimatwasser) wird dazu empfoh- len. Durch Zusatz von Eisessig oder Trichloressigsäure wird es dagegen angegriffen. 739. Zur Färbung der Schnittpräparate eignen sich besonders die Methoden von Dominici mit Orange-Eosin- Toluidinblau (s. § 440), von Maximow mit Azur-Eosin (s. § 442), von Pappenheim (Panchrom § 448), panoptisches Gemisch § 446), nach Kardos (§ 722), mit Triazid (§ 436) und nach Giemsa (vgl. § 445 und nachfolgende). 740. Schridde verdünnt zur Schnittfärbung mit Giemsa- lösung 20 Tropfen (= 0,4 com) der Stammlösung mit 10 ccm dest. Wasser (über die Ausführung vgl. § 718) und färbt 20 Minuten bis 24 Stunden. Ev. muß man nach etwa einer halben Stunde die Farblösung nochmals erneuern. Hierauf wäscht man sorgfältig in Brunnenwasser aus, trocknet mit Filtrierpapier ab und bringt durch reinstes Azeton (Kahl- baum), in dem keine Farbwolken abgehen dürfen, in Xylol und Balsam. Das Azeton muß völlig säurefrei sein, allenfalls setzt man ein paar Tropfen Kahumkarbonat zu. Schmorl schüttelt zur Reinigung das Azeton mit einer konz. wässe- rigen Lösung von Kalium acetic. gut durch und läßt ab- setzen. 741. Mit der Schult ze-Winklerschen a-Naphthol-Oxy- dase-Reaktion lassen sich in Myeloblasten und Myelozyten Granulationen darstellen, während Lymphoblasten und Lymphozyten davon frei sind. Je nach Fixierung und Ausführung der Färbemethode färben sich die a-, ß-, y- oder e-Granula, und zwar geben L die Methoden A von Schnitze und die Methode von Loele an a-Zellen starke, an neutrophilen schwache partielle und inkonstante, an amphooxyphilen Zellen keine Reaktion, IL die Methode B von Schultze und die von Giercke auch an neutrophilen und amphooxyphilen Granulationen starke Reaktion. Bei starker Formolisierung tritt bei den zwei letzten Methoden eine Differenz der Oxydasefärbung dieser Zellgranula ein (a-Granula blau, die übrigen braun). Alle Oxydasereak- tionen färben auf alle Fälle die a-Granula. (Weiteres bei Pappenheim und Nakano 13.) Vergl. auch § 605 ff. § 742 — 746. Untersuchung des Blutes. 185 742. Auch mit der »Dopa«- Reaktion (vgl. § 609) fär- ben sich die Granula des myeloischen Systems. 743. Bei vitaler Karmin- oder Trypanblau-Injektion treten nach Asschoff (13) und Kyiono (14) im Blute rot bzw. blau granulierte mononukleäre Zellen auf, Histiozyten, welche sich hauptsächlich aus losgelösten Retikuloendothelien von Milz, Leber, Knochenmark und Lymphdrüsen rekrutieren (da- gegen Pappenheim 13c und Netousek 14). 744. Zur Darstellung der Plasma- und Mastzellen fixiert man am besten in abs. Alkohol (auch das Orthsche Gemisch oder Formol ist möglich) und färbt die Zelloidin- oder Paraffinschnitte 10 Minuten in polychromem Me- thylenblau von Unna. Dann spült man 2 — 3 Minuten in dest. Wasser ab und differenziert % bis mehrere Minuten in der Glyzerinäthermischung von Unna, die man dazu mit 4 Teilen dest. Wasser verdünnt, bis der Schnitt kornblumenblau erscheint. Nach 5 Minuten langem Aus- waschen in Wasser Abtrocknen mit Fließpapier, kurz in abs. Alkohol, Xylol, Kanadabalsam. Die Granula der Mast- zellen sind rot, die der Plasmazellen blau, ebenso die Kerne. 745. Auch bei Anwendung der Pappenheim-Unna- schen Methylgrün-Pyroninfärbung (vgl. § 434) treten die Plasmazellen durch ihr tiefrotgefärbtes Protoplasma und den blaugrüngefärbten »Radkern« deutlich hervor. C. Darstellung von Fibrin. 746. Fibrinfärbung nach Weigert. Fixierung in abs. Alkohol, doch ist auch Sublimat oder Formol möglich. Bei Fixierung in chromhaltigen Flüssigkeiten müssen die Schnitte vor der Färbung auf 2 — 3 Stunden in 5% ige Oxalsäure und hierauf ca. % Stunde in eine 0,3% ige Lö- sung von übermangansaurem Kali gestellt werden. Färbung: 1. Die aufgeklebten Paraffinschnitte kom- -men nach Entfernung des Paraffins auf mindestens 10 Mi- nuten in konz. Anilinwasser-Gentianaviolettlösung (s. § 407). 2. Flüchtiges Abspülen in 0,6%iger Kochsalzlösung oder in Wasser. 3. Einstellen für 10 Minuten in Jod- Jodkalilösung (1:2: 300). 4. Abtrocknen mit einer mehrfachen Lage von Fließ- papier. 5. Differenzieren in einer Anilinöl-Xylolmischung (2:1), solange bis das Fibrin distinkt violett erscheint, während das übrige Gewebe sich mehr oder weniger entfärbt hat. 186 . Untersuchung des Blutes. § 747 — 750. Hierauf muß das Anilinöl durch Xylol sorgfältig entfernt werden, da sonst die Färbung nach kurzer Zeit verdirbt. Dann Einschluß in Kanadabalsam. Eine Vorfärbung der Kerne mit Parakarmin od. dgl. ist sehr empfehlenswert. 747. Nach Beneke (93) kann man durch Zusetzen von mehr Xylol zum Anüinölxylolgemisch (also 2:3) auch Binde- gewebsfasern, Knochenfibrillen, Sharpeysche Fasern (s. § 878), Epithelfasern im Plattenepithel (s. §1308) Interzellularbrücken, Gallenkapillarien u. a. darstellen. Man muß die Differenzie- rung unter dem Mikroskop verfolgen und, wenn der richtige Entfärbungsgrad erreicht ist, sofort unterbrechen und mit Xylol gut auswaschen. 748. Fibrinfärbung nach Kockel (99). 1. Übertragen von 5 .« dicken, mit Eiweißwasser auf- geklebten Paraffinschnitten durch Toluol, Alkohol und Wasser in* 1% ige wässerige Chromsäwrelösung für 5 — 10 Minuten. 2. Ganz kurzes Auswaschen in Wasser (höchstens 10 bis 20 Sekunden! Die Schnitte dürfen ihre gelbe Farbe nicht verlieren). 3. 15 — 20 Minuten langes Färben in folgender Hämato- xylinlösung von Weigert: 1 g Hämatoxylin wird gelöst in 10 ccm abs. Alkohol und dann 90 ccm dest. Wasser und 1 ccm gesättigte wässerige Lithionkarbonatlösung zugesetzt. 4. Abspülen in Wasser, einstellen in eine ca. 10% ige wässerige Alaunlösung, bis die Schnitte dunkelblau sind (ca. 1 Minute). 5. Auswaschen in Wasser und Differenzieren in der Wei- gertschen Borax-Ferricyankahumlösung (Borax 2 g; Ferri- cyankalium 2,5 g; dest. Wasser 100 ccm), die mit der drei- fachen Menge W^asser verdünnt wird. 6. Auswaschen in Wasser, ev. Kernfärbung mit Parakar- min usw. Die Kockelsche Methode färbt neben Fibrin auch Muskeln (Fibrillen!), Blutkörperchen, Gallenkapillaren usw. 749. Schueninoff färbt Fibrin mit dem § 366 ange- gebenen Malloryschen Hämatoxyhn 15 — 20 Minuten, spült mit Wasser ab und behandelt die Schnitte 20 Minuten. bis 20 Stunden weiter mit 5 — 10%iger Phosphorwolframsäure, wäscht mit Wasser gut aus, dann Alkohol usw. 750. Um Fibrin auf dem Objektträger darzustellen, lasse man einen Blutstropfen ein paar Stunden in einer feuchten Kammer ruhig hegen, bedecke das Ganze mit einem Deckglase und wasche mit Wasser ab, indem man von der einen Seite des Deckglases Wasser zusetzt und auf der anderen Seite mit Fheßpapier absaugt. Sind die meisten Blutkörperchen weggeschwemmt, so setzt man Jod-Jodkahumlösung hinzu, wodurch sich die Fibrinfädchen und -netze intensiv gelb bis braun färben. § 751 — 754. Untersuchung des Blutes. 187 D. Verschiedenes. 751. Über die Darstellung von Oxyhämoglobin-, Hä- moglobin- und Methämoglobinkristallen vgl. Hammarsten (14) S. 264ff. Über die Darstellung von Häminkrist allen ebenda S. 275. 752. Hämatoidinkristalle findet man als rotgelbe, aus fuchsroten, rhombischen, eisenfreien Kristallen bestehende Massen in apoplektischen Herden, in corpora lutea des Ovars u. dgl. 753. Der Blutkreislauf läßt sich am einfachsten an den im Sommer so leicht zu beschaffenden Kaulquappen von Fröschen oder Kröten untersuchen. Man bedeckt dazu den Rumpf einer auf den Objektträger gelegten Larve mit etwas feuchter Watte. Das Tier schlägt zuerst ziemHch lebhaft, beruhigt sich aber bald, worauf man die Blutgefäße des Flossensaumes mit mittlerer Vergrößerung ohne Mühe ein- stellen und beobachten kann. Will man den Blutkreislauf am erwachsenen Frosch untersuchen, dann injiziert man demselben, um ihn unbe- weglich zu machen, etwa 0,3 — 0,6 ccm eines 0,5% igen Ku- rareextraktes in Glyzerinwasser in den Rückenlymphsack. Dieses Gift wirkt bekanntlich auf die motorischen Endorgane der quergestreiften Skelettmuskulatur, nicht aber auf die des Herzens und der glatten Muskulatur, weshalb auch der Blut- kreislauf nicht behindert wird. Auch die sensiblen Bahnen bleiben frei. 754. An einem so kurarisierten Frosch kann man den Blutkreislauf, z. B. an den durchsichtigen Schwimm-Mem- branen, ohne weiteres beobachten. Um die Membran zu spannen, zieht man zwei Zehen auseinander und befestigt sie vermittelst zweier sog. Insekten-( Karlsbader-) Nadeln über einer in eine Korkplatte mit einem Locheisen gemachte Öffnung. Die Platte wird so groß gewählt, daß auch der Frosch darauf Platz hat. Man bringe die Öffnung der Korkplatte über die Öffnung der Tischplatte des Mikroskops und beobachte. Die Stellen, an welchen man den Blutkreislauf beobachten kann, sind sehr zahlreich. Man kann, um beim Frosche zu bleiben, die aus dem Munde gezogene und mit Nadeln über eine mit Ausschnitt versehene Korkplatte gespannte Zunge dazu verwenden; auch das Mesenterium läßt sich durch einen in der Axillarlinie gemachten Einschnitt an einer Darm- schhnge aus der Bauchhöhle hervorziehen, siehe Cohnheim (67b); für die Lunge verfahre man nach Holmgren (74) (Holmgrensche Kammer). Ewald (97) empfiehlt die Untersuchung des Blutkreis- laufes an der Tritonlunge und gibt die erforderhchen An- weisungen hierzu, S. 248. Ferner kann der Blutkreislauf der Harnblase (H allsten. 188 Untersuchung des Blutes. § 755—756. 86) an den quergestreiften Muskeln usw. untersucht werden. Schwanzpartien kleiner Fische und Fischembryonen, äußere Kiemen von Tritonenlarven und namentlich die so langen und üppigen äußeren Kiemen der Salamanderembryonen können, wenn gerade das Material hierzu vorhanden ist, ver- wertet werden. Auch Keimscheiben vom 2. oder 3. Tage der Vogelembryonen (Hühnchen, siehe §1463) können zu dem- selben Zwecke gebraucht werden. 755. Man achte bei diesen Untersuchungen auf das Vor- handensein des axialen und Wandstromes, auf das Pulsieren in den Arterien usw. Man sieht unter günstigen Umständen die Umkehr des Stromes in den Kapillaren. An den Bifur- kationsstellen der Kapillaren bleiben oft die Blutkörperchen hängen und werden ganz enorm (auf das zwei- bis dreifache ihrer ursprünghchen Länge) gedehnt. Wird ein Blutkörperchen wieder frei, so nimmt es die ursprünghchen Dimensionen an (Elastizität). An Mesenterien, aber auch in der Lunge, treten alsbald infolge der Vertrocknung, Temperaturschwankungen usw. Zu- stände auf, die als Anfänge der Entzündung aufgefaßt werden, und man sieht u. a. das Auswandern der weißen Blutkörper- chen durch die Gefäßwände. 756. Zum Zählen der Blutkörperchen benützt man gewöhnUch den Apparat von Thoma-Zeiß, der aus zwei Kapillarpipetten und einer Zählkammer besteht. Auf der zur Zählung der Erythrozyten bestimmten Misch- pipette findet man die Marken 0,1, 0,5, 1,0 und 101 einge- ätzt, auf der für weiße Blutzellen bestimmten die Mar- ken 0,5, 1,0 und 11. Das Aufsaugen des Bluttropfens ge- schieht durch ein mit Mundstück versehenes Gummi- schläuchchen. Besser und reinlicher ist die von Pappenheim angegebene Saugvorrichtung, nämlich eine auf das Pi- Eettenende luftdicht aufgeschliffene, verschiebbare Glas- ülse (bei Leitz erhältlich). Die Zählkammer ist genau 0,1 mm tief. Ihr Boden ist in mikroskopisch kleine Quadrate eingeteilt, wobei je 16 Quadrate durch stärkere Linien immer besonders abgegrenzt sind. Seitenlänge eines jeden Quadrates 0,02 mm, Raum- Inhalt ^/4ooo cmm. Von den zahlreichen Modifikationen der in ihrer ur- sprünghchen Form veralteten Zählkammer sei besonders die Neubauersche Netzteilung empfohlen. Pappenheim bevorzugt die Bürkersche Kammer in Verbindung mit der Türkschen Netzteilung. Das Prinzip ist überall dasselbe. Reinigung. Die Instrumente sind peinhch sauber zu halten und nach jeder Benützung zu reinigen (mit dest. Was- § 756. Untersuchung des Blutes. 189 ser und Seidenpapier, nicht mit Toluol, Äther o. dgl., da sonst die Verkittung gelöst wird!). Durch die Pipette saugt man mehrmals dest. Wasser, dann abs. Alkohol, dann Äther. Zu- letzt bläst man zum Trocknen Luft durch. Bei häufigem Ge- brauch empfiehlt sich zur Reinigung der Gebrauch einer Was- serstrahlluftpumpe. Etwaige Blutgerinnsel löst man vorsich- tig mit etwas erwärmter Kalilauge. Ausführung einer Zählung, a) Rote Blutkörperchen: Man saugt sorgfältig einen frischen Bluttropfen in die für Erythrozyten bestimmte Kapillare, und zwar bei normalem Blut bis zur Marke 0,5, bei anämischem bis zur Marke 1,0. Dann zieht man nach sorgfältigem Abwischen der Spitze des Röhrchens unter Vermeidung von Luftbläschen bis zur Marke 101 physiologische Kochsalzlösung oder Hayemsche Flüssigkeit (s. § 684) nach (ev. kann man der Mischflüssig- keit, um die Unterscheidung von weissen Blutzellen zu erleich- tern, etwas Methylviolett zusetzen, ca. 0,1 g auf 250 ccm). Hierauf mischt man die Flüssigkeit 1 Minute lang durch leichtes Schütteln, wobei man die Entstehung von Schaum vermeide, bläst ohne zu warten, die ersten Tropfen aus der Kapillare, bringt einen noch folgenden kleinen Tropfen in die Mitte der Zählkammer und schiebt sogleich unter Druck und bei Vermeidung von Luftblasen das zur Zählkammer gehörige Deckglas auf. Bei richtiger Ausführung müssen an den Rändern Newtonsche Farbringe erscheinen. Nach einigen Minuten zählt man eine größere Zahl von Quadraten durch, wobei man, um Doppelzählungen zu ver- meiden, die auf den Linien eines Quadrates gelegenen Kör- perchen in der Weise mitzählt, daß man bei jedem Quadrat immer nur die auf der linken vertikalen und auf der oberen horizontalen Begrenzungslinie gelegenen Körperchen mitzählt. In dieser Weise zählt man für genaue Bestimmungen etwa 1000 Erythrozyten. Berechnung: War das Blut bis zur Marke 1,0 aufgeso- gen, so ist die Verdünnung 1 : 100. Der Raum über jedem Quadrat mißt aber V4000 qnim. Man multiphziert daher die Summe der gezählten Erythrozyten mit 400 000, dividiert durch die Zahl der gezählten Quadrate und erhält so die An- zahl der Erythrozyten in 1 cmm Blut. Hat man das Blut nur bis zur Marke 0,5 eingesogen, so ist die Verdünnung 1 : 200, und man hat das Ergebnis noch mit 2 zu multiphzieren. Bei einiger Übung verfährt man folgendermaßen: Aufsau- gen bis 0,5; verdünnen bis 101 usw. Dann zählt man 2 verti- kale Reihen der mittleren großen Quadratfelder (— 40 kleine Quadrate) und multiphziert die Summe mit 2000. b) Weiße Blutzellen: Zur Zählung der weißen Blut- zellen saugt man mit der zweiten Pipette einen Bluttropfen bis zur Marke 1,0 und verdünnt durch Nachsaugen der Misch- flüssigkeit bis zur Marke 11,0 (Verdünnung 1 : 10, bei leu- 190 Untersuchung des Bindegewebes. § 757 — 759. kämischem Blut bis 0,5 und Mischflüssigkeit bis 11,0, Verdün- nung = 1 : 20). Als Mischflüssigkeit benützt man, um die Erythrozyten zur Erleichterung der Zählung unsichtbar zu machen, 5% ige Essigsäure, der man ev. auf -250 ccm 0,025 g Methylgrün oder Vesuvin zusetzt. Zur Bestimmung zählt man die 9 großen Quadrate der Zählkammer durch und mul- tipliziert den daraus berechneten Durchschnittswert mit 100 (bei Ansaugen bis 0,5 mit 200). Bei exakter Herstellung der Präparate genügt es auch, nur die 4 großen Eckquadrate auszuzählen, die Summe davon durch 4 (bei Ansaugen bis 0,5 mit 2) zu dividieren und das Ergebnis mit 100 zu multiplizieren. Zeigen die Einzelwerte der einzelnen Quadrate größere Unterschiede, so deutet das auf eine fehlerhafte Herstellung des Präparates (ungleichmäßige Mischung, Sedimentierung der Bluttropfen, schlechtes Aufliegen des Deckglases u. dgl.). 757. Zur Feststellung, in welchem Prozentverhältnis die einzelnen Arten der weißen Blutzellen vorhanden sind, ermittelt man einerseits, wie eben beschrieben, die Gesamtzahl der weißen Blutzellen, anderseits mustert man an einem gleich- zeitig angefertigten und in der gewünschten Färbung tin- gierten dünnen Ausstrichpräparat 300 — 500 weiße Blutzellen durch und bestimmt dabei, wie viele von ihnen den ein- zelnen Gruppen (neutrophile, eosinophile Leukozyten, Lympho- zyten usw. zugehören. Daraus lassen sich dann alle weiteren Zahlenverhältnisse errechnen. Weiteres s. Pappenheim 19. i6. Kapitel. Untersuchung des Bindegewebes. A. Untersuchung des frischen Präparates. 1. Kollagenes Bindegewebe. 758. Ein leicht zu beschaffendes Objekt zur Unter- suchung frischen parallelfaserigen Bindegewebes findet man in den Sehnenfasern des Mäuseschwanzes. Man zwickt dazu mit den Fingernägeln ein paar Endwirbel des Schwanzes einer eben getöteten Maus samt der Haut durch und zieht an dem nur noch an den Sehnenfasern hängenden Stück fest an. Auf diese Weise läßt sich ein ganzer Strang dünner, glänzender, langgestreckter Sehnenfaser herausziehen. 759. Ein Stückchen davon wird mit einer scharfen Schere abgeschnitten und nach der Methode der Halbein- trocknung (Ranvier 89) auf dem Objektträger gefasert, d. h. man nimmt möglichst wenig Flüssigkeit, nur gerade so viel, als nötig ist, um ein Austrocknen des Präparates zu verhüten. Operiert man rasch, so genügt mehrmaliges Anhauchen, braucht man länger, so bedeckt man mit einem §760—767. Untersuchung des Bindegewebes. 191 kleinen Tropfen einer physiologischen Kochsalzlösung, Auf keinen Fall nehme man zu viel Flüssigkeit, da dadurch das Arbeiten sehr erschwert wird. Bei richtiger Technik gehngt es dann verhältnismäßig leicht, die Sehnenfasern zu einer zarten, schleierartigen, aus feinsten kollagenen Fasern bestehenden Membran auseinanderzubreiten. Der Anfänger neigt zu dem Fehler, das zu zerzupfende Stück- chen zu groß zu nehmen; dann erschöpft sich die Geduld, bevor das Präparat bis zur nötigen Feinheit bearbeitet ist. 760. Das zerzupfte Präparat untersuche man zunächst in physiologischer Kochsalzlösung und sodann in einer konzentrierten Lösung von Neutralrot in physio- logischer Kochsalzlösung. 761. Setzt man verdünnte, etwa l%ige Essigsäure zu, so quellen die Fibrillen sehr stark auf und werden zu- letzt so durchsichtig, daß sie kaum mehr zu sehen sind. Dagegen treten die Zellkerne nunmehr deutUch hervor. 762. Kalilauge, namentlich verdünnt und in der Wärme, bringt Sehnenfasern und Fibrillen zur Lösung. 763. Die die Fibrillen verklebende muzinartige Sub- stanz, das Bindemittel, löst sich in Kalk- und Baryt - Wasser — eine für Bindegewebefibrillen von Rollet (58) empfohlene Isolationsmethode. Mit Kalkwasser behandle man dazu frische Sehnenfasern 6 — 8 Tage; mit Baryt- wasser 4 — 6 Stunden. Will man solche Präparate dauernd konservieren, so muß man das Kalk- bzw. Barytwasser nach Beendigung der Mazeration vorsichtig neutrahsieren. Die fibrilläre Auffaserung von Bindegewebsfasern kann man auch im nekrotischen Gewebe häufig beobachten (Ran- vier 89). 764. Auch das große Netz, z. B. des Kaninchens, ist zu Untersuchung von fibrillärem Bindegewebe (areoläres Ge- webe) sehr geeignet. Will man hier gleichzeitig noch die Endothelzellen darstellen, dann versilbere man nach § 664 _. und färbe mit Karmin und ev. Pikrinsäure nach. 765. Embryonales Bindegewebe untersuche man an Hühner- und Kaninchenembryonen. Gallertgewebe nimmt man am besten vom Nabelstrang. 766. Das retikuläre (adenoide) Gewebe studiert man am besten in Lymphdrüsen und ähnlich gebauten Organen. 767. Um die Elemente des Koriums darzustellen, be- dient man sich folgender Methode: Einem eben getöteten Hunde wird die Haut leicht abgehoben und eine Silber- nitratlösung 1 pro mille subkutan (oder vielmehr sub- epidermoidal) eingespritzt. Es bildet sich dann eine kleine 1^2 Untersuchung des Bindegewebes. § 768 — 7^0. Ödemkugel, innerhalb weicher die Fasern etwas gedehnt und im gedehnten Zustande fixiert werden. Es wird ein einer solchen Ödemkugel mit einer krummen Schere ent- nommenes Fetzchen auf dem Objektträger gewaschen und unter der Lupe zerfasert, ev. durch Zusatz eines Tropfens Pikrokarmin auf dem Objektträger gefärbt. Dabei isoHert man Bindegewebsbündel, elastische Fasern, gutfixierte Binde- gewebszellen, ev. Fettzellen. An den Bindegewebsfasern sieht man oft spiralig verlaufende, einschnürende Fasern, die sich anders verhalten wie die Bindegewebsfibrillen. Vgl. Kapitel Haut. Dabei erhält man auch häufig sehr lehrreiche Bilder von Fettzellen. 2. Elastische Gewebe. 768. Grobe Fasern des elastischen Gewebes ver- schafft man sich vom Ligament, nuchae z. B. eines Rin- des; feinere Fasern findet man ziemlich zahlreich in der lockeren Adventitia großer Gefäße. Allerfeinste Faser- netze trifft man im Mesenterium z. B. der Katze und in der Membrana subhyaloidea des Frosches (vgl. Loginow). Die Entwicklung der elastischen Fasern läßt sich sehr schön in den Eihäuten verfolgen. Das Zerzupfen ist hier schwieriger als beim kollagenen Gewebe. Die isolierten Fasern krümmen sich meist eigentümlich (Bischofsstab- form). 769. Durch Zusatz von verdünnter Essigsäure oder Kalilauge wird das elastische Gewebe nicht verändert; die elastischen Fasern sind im Gegensatz zu den kollagenen besonders der Kalilauge gegenüber sehr resistent. Diese letztere Eigenschaft kann man benützen, um die feinen und feinsten elastischen Fasern zur Darstellung zu bringen. Man läßt z. B. auf eine dünne ausgebreitete Lamelle von Lungengewebe verdünnte Kalilauge einwirken; nach ein paar Stunden löst sich das kollagene Bindegewebe, Blut usw., und es bleiben nur mehr die feinsten, die Alveolen umspinnenden elastischen Fäserchen zurück. 770. Aus den zahlreichen Angaben Mails (91 und 96) über das Verhalten des Bindegewebes gegen verschiedene Reagenzien sei besonders hervorgehoben : Die elastischen Fasern bleiben in Essigsäure (auch beim Kochen in 20%iger) unverändert, sie werden nur brüchig; in konzentrierter Salzsäure gekocht, zerfällt die elastische Faser sehr rasch; in 10%iger bleibt sie bei gewöhnhcher Temperatur unverändert, in 50%iger löst sie sich in 7 Tagen, in kon- zentrierter schon am zweiten Tage ; zuerst löst sich das Innere der Faser, dann die »Fasermembran«. Zur Darstellung der §770. Untersuchung des Bindegewebes. 19^ letzteren kocht man die elastischen Fasern ein paarmal in konzentrierter Salzsäure auf und gießt das Ganze in kaltes Wasser aus. Manchmal sieht man an den Membranen eine longitudinale Strichelung, welche auf einen fibrillären Bau hindeutet. Konzentrierte Kahlauge zerstört die Faser in weni- gen Tagen, schwache Lösungen nur sehr langsam; eine l%ige braucht dazu Monate, eine 2% ige einen Monat, eine 5% ige 3 Tage, 10% ige einen Tag, 20— 40% ige Stunden. Eine schwache Kalilauge löst, auch kochend angewandt, die elasti- schen Fasern nicht auf; sie werden darin auch nicht brüchig. In 5- oder 10%iger Kalilauge gekocht, isolieren sich die »Fasermembranen«, ebenso in 20%iger kalter Lösung in 1 bis 2 Tagen. Durch Pepsin zerfällt der Inhalt der Faser, die »Membranen« bleiben übrig. Trypsin löst die elastischen Fasern rasch auf, nicht aber das Sehnen- und das retikulierte Gewebe, welch letztere tage- lang darin unverändert bleiben. Die Fäulnis zerstört das Lig. nuchae in wenigen Tagen; zuerst zerfällt das Innere der Faser, dann die »Fasermembranen«. Um den Faserinhalt und die »Fasermembranen« zu demon- strieren, empfiehlt sich eine Färbung mit Magentarot (ein Körnchen Magentarot auf 50 g Glyzerin + 50 g Wasser). Der Inhalt färbt sich rot, die Faserscheide bleibt farblos. Wird eine Sehne gekocht, so wird sie kürzer. Fixiert man die Sehne vor dem Kochen, so verkürzt sie sich nicht. Das adenoide Gewebe schrumpft beim Kochen, quillt nach kurzer Zeit und löst sich später auf. Sehnengewebe und adenoides Gewebe schrumpfen schon bei 72° C. Behandelt man sie aber eine kurze Zeit mit y2%i8'er Osmiumsäure, so tritt die Schrumpfung erst bei 95° C ein. Sind das Retikulum oder die Sehne durch Erwärmung geschrumpft, so lassen sie sich sehr leicht mit Pankreatin (Trypsin) verdauen und werden durch Fäulnis sehr leicht zerstört. In konzentrierter und in einer Essigsäure von unter ^/2o% quellen die Sehnenfasern nicht. In Säuren zwischen 1/2 und 25% quellen sie hingegen auf; in 25%iger werden sie liach 24 Stunden gelöst. Ameisensäure in stärkster .- Verdünnung, ^/5oo%ig z. B., bringt Sehnenfasern in kurzer Zeit zum Quellen. Zachariad^s. In Salzsäure von 0,01% bis 6 % quellen die Sehnenfasern auf. In einer 6 — 25 % igen Lösung bleiben sie eine Zeitlang ganz unverändert, und erst in konzentrierter Säure lösen sie sich. 10% ige Salpeter- säure verändert das Volumen der Sehnenfaser kaum; ^/6o%ige wirkt am stärksten quellend. Zachariades. Das retiku- lierte Gewebe quillt in Salzsäure bis 3%, bleibt unverändert zwischen 3 — 10% und löst sich nach 24 Stunden in 25%iger Säure und in höheren Konzentrationen derselben. Nach Be- handlung mit verdünnter Säure löst sich beim Kochen die Sehne viel rascher auf als das retikuläre Gewebe. Romeis, Taschenb. d. mikrosk. Technik. 8. Aufl. I3 194 Untersuchung des Bindegewebes. § 771 — -772 Im natürlichen Magensaft des Hundes lösen sich die Sehnen nicht schneller als das elastische Gewebe auf; im künstlichen dagegen löst sich zuerst die Sehne, dann das retikulierte Ge- webe, dann die elastische Faser auf (vgl. über fraktio- nierte Verdauung, Spalteholz, 03). Pankreatin greift weder die Sehne noch das retikulierte Gewebe an. Werden beide gekocht, so werden sie leicht in Pankreatin verdaut. Die Fäulnis zerstört weder die Sehne noch das Retikulum, wenn sie der Leiche entnommen worden sind. In der Leiche, und namentlich bei höherer Temperatur (37°), zerfallen beide Gewebe in kurzer Zeit. 3. Untersuchung des Bindegewebes mit Hilfe der Verdauungsmethoden. 771. Für manche Untersuchungen läßt sich mit Vor- teil das verschiedene Verhalten der einzelnen Gewebs- bestandteile gegenüber Trypsin (Pankreatin) benützen. Da- bei ist aber zu beachten, daß das Resultat je nach der Wirksamkeit des Fermentes, der Dauer der Einwirkung, der Vorbehandlung des Objektes sowie auch je nach der Tierart variieren kann. Im allgemeinen werden kol- lagenes und retikuläres Bindegewebe, Keratin, Fett und Kohlehydrate sowie das Chromatin der Kerne durch Trypsin nicht oder nur wenig ver- ändert, während die eigentlichen Eiweißkörper, ferner Muzin, Leim, elastisches Gewebe, Chon- dromukoid u.a. gelöst werden. Auch junge kollagene Fibrillen leisten dem Trypsin wenig Widerstand. 772. Ewald und Kühne (74) machten bei Verdauung mit schwach alkalischem Glyzerinpankreasextrakt (bei 35^ C) folgende Feststellungen : 1. Sehnen zerfallen in einzelne Faszikel oder in Fibrillen; von allen anderen Bestandteilen bleiben nur geschrumpfte Kerne erhalten, die leicht abfallen. 2. Alveoläres Bindegewebe des Mesenteriums ver- hält sich wie Sehne; Endothelien werden gelöst bis auf die Kerne. 3. Retikuläres Bindegewebe wird in vollkommener Reinheit dargestellt. 4. Hyaliner Knorpel. Die Zellen werden bis auf die Kerne gelöst, die Grundsubstanz stellt ein eigenartiges, etwas körniges Netzwerk dar, von dem Verhalten des Kollagens. 5. Elastischer Knorpel verhält sich wie hyaliner; die elastischen Fasern verschwinden. 6. Elastisches Gewebe wird gelöst. 7. Sogenannte strukturlose Membranen werden vollkommen gelöst. § 773 — 777. Untersuchung des Bindegewebes. 195 8. Die Leber ist bis auf die Kerne und das Kollagen voll- kommen verdaulich. Das fibrilläre Bindegewebe erstreckt sich bis zur Vena intralobularis. 9. Muskeln werden bis auf die bindegewebigen Bestand- teile verdaut. 10. Von den Epithelien der Schleimhäute bleiben nur die Kerne zurück. 11. Bei Schnitten menschlicher Oberhaut fällt zuerst das Rete Malpighii heraus, dann w^erden Stachelzellen isoliert, hierauf zeigen sich die Zellen der Hornschicht wie hohl mit doppelter Kontur. 773. Man benützt jetzt meist das bei Merck oder bei Grübler erhältliche Pankreatinum siccum depuratum, von dem man in 100 com einer 0,3% igen wässerigen Soda- lösung eine Messerspitze voll löst. Um Fäulnis zu ver- hüten, setzt man noch 2 — 3 com Toluol (besser als Chloro- form) zu und schüttelt gut durch. Für exakte Unter- suchungen empfiehlt sich steriles Arbeiten. Die Verdauung erfolgt meist 10 — 24 Stunden oder länger bei 37^ G. Durch Erwärmen über 50^ C wdrd das Ferment unwirksam. Man prüfe das zur Verwendung kommende Trypsin ev. durch einen Probeversuch an Fibrin, das von einem guten Prä- parat in einigen Stunden aufgelöst sein muß. 774. Da Pankreatin nur bei völlig entfettetem Prä- parat exakt wirkt, empfiehlt es sich, das Objekt vorher durch Einlegen in Benzin, Äther od. dgl. zu entfetten. 775. Die Verdauung kann am Schnitt (s. § 777 f.) oder am Stück (s. § 780) vorgenommen werden. Will man die feinsten Fäserchen erhalten, so läßt man Paraffin- schnitte, ohne das Paraffin zu entfernen, auf der Verdau- ungsflüssigkeit schwimmen (s. § 779). Weiteres bei Spalte- holz. 776. Die Vorbehandlung des Bindegewebes hat einen wesentlichen Einfluß auf die Resultate der Ver- -dauung desselben. So sind z. B. in Osmiumsäure fixierte elastische Fasern in Pepsin unlöslich. Mit sehr schwachen Chromsäurelösungen (V3000) i^ Lichte behandelte elastische Fasern sind in Trypsin unveränderlich, werden dagegen verdaut, wenn sie im Dunkeln ebenso fixiert waren. Das- selbe gilt für kollagene Gewebe. (Ewald 90.) 777. Schnittverdauung (nach Björkenheim): Um ein Abschw'immen der Präparate zu verhüten, ist es nötig, daß die Objektträger vollkommen rein und fettfrei sind. Man reinige sie nach § 37 oder lege sie 3 — 4 Tage in Seifen- lösung. 1. Fixierung in Alkohol oder Sublimat, nicht in 13* 196 Untersuchung des Bindegewebes. § 778 — 779. Formol, Chromsäure, Osmiumsäure. 2. Einstellen der auf Wasser aufgeklebten, 6 — 8 jj, dicken Schnitte in Xylol (3 — 4 Stunden), von hier durch abs. Alkohol für 6 — 7 Tage in Benzin (Entfettung). 3. Abs. Alkohol, 96%iger Alkohol, und für einige Minuten in dest. Wasser. 4. Einstellen der Schnitte für 24 Stunden in Barytwasser, um die Schnitte aufzulockern und dadurch die Verdauung zu begünstigen (Kolster). 5. Abspülen in fheßendem Wasser. 6. Verdauen in Pankreatinlösung (1 Messerspitze pancreatin. siccum auf 40 ccm einer l%igen Sodalösung) 6 — 24 Stunden bei 37^ G. 7. Vorsichtiges Abspülen in dest. Wasser. 8. Färbung in Malloryschem Hämatoxylin. 9. Vorsichtiges Abspülen in dest. Wasser; Alkohol usw.; Balsam. Die Zeit, wie lange die Schnitte in der Verdauungsflüssigkeit liegen sollen, läßt sich von vornherein nicht bestimmen; junge Uteri brauchen etwa 6 Stunden, Vaginen von Greisinnen 3 Tage, bis das Reticulum freiliegt. Verdaut man längere Zeit, als nötig ist, so löst sich das Bindegewebe vom Objektträger ab. Überhaupt hat das Abspülen der Präparate nach der Ver- dauung, um Verluste zu vermeiden, sehr behutsam zu geschehen. 778. Hoehl entfettet die aufgeklebten, paraffin- befreiten Schnitte 1 — 3 Tage in Benzin bei 37^ G, bringt durch Alkohol für 10 — 20 Minuten in Wasser und dann in die § 777 angegebene Verdauungsflüssigkeit (10 — 24 Stun- den bei 37^ G). Dann vorsichtiges Auswaschen in fließen- dem Wasser, Färbung in einer 0,5% igen wässerigen Lösung von Ferridammonium tartaricum für 1 — 24 Stunden, dann kurz in Wasser und 3 — 24 Stunden in eine 0,5% ige wässe- rige (gereifte) Hämatoxylinlösung. Dann Wässern usw. Sind nach Abspülen des Farbstoffes die Bälkchen des Reticulums noch nicht tiefschwarz, so kommt das Prä- parat noch auf 20 — 30 Minuten in die stets frisch zu berei- tende Eisensalzlösung zurück. 779. Bei sehr zarten Schnitten läßt man die Verdauungsflüssigkeit nach dem Vorgange G. M. Jack- sons vor Entfernung des Paraffins einwirken, indem man die 6 — 8 fx dicken Schnitte entweder aufgeklebt in die Lösung stellt oder besser sie auf ihr schwimmen läßt. Man muß die Trypsinlösung jedoch länger als sonst einwirken lassen (1 — 4 Tage). Die verdauten Schnitte werden aus- gewaschen und vor Lösung des Paraffins noch mit Eisen- hämatoxylin gefärbt (1 Tag Eisenalaun, 1 Tag Hämatoxyhn, differenzieren unnötig). Dann kann man nach Auswaschen, ^. § 780 — 783. Untersuchung des Bindegewebes. 197 Aufkleben und Trocknen der Schnitte das Paraffin durch Xylol lösen und in Balsam einschließen. 780. Stückverdauung: Flint fixiert dazu die Organe in Garnoyscher Flüssigkeit (s. § 118), zerschneidet sie in nicht über 3 mm große Stückchen und entfettet diese ca. 1 Woche im Soxhletapparat mit Äther. Dann werden sie durch die Alkoholreihe in Wasser gebracht, 24 Stunden ausgewaschen und mit Pankreatinlösung (alle 48 Stunden erneuern!) bei 37^ C so lange verdaut, bis reines Binde- gewebe zurückbleibt. Die Zeitdauer variiert, durchschnitt- hch dauert der ganze Prozeß 1 Monat. 4. Färbungsmethoden. a) Färbung des kollagenen Gewebes. 781. An erster Stelle ist die ausgezeichnete Binde- gewebsfärbung von Mallory (00) zu nennen. Fixierung in Sublimat, Zenkerscher, Orthscher Flüssigkeit oder nach § 192, 193 oder 194. Färbung der Schnitte: 1. Färben in einer 0,l%igen wässerigen Säurefuchsinlösung 3 Minuten. 2. Kurzes Aus- waschen in Wasser und Fixieren der Färbung durch Ein- stellen in l%ige Phosphormolybdänsäure 3 — 5 Minuten. 3. Auswaschen in Wasser und 2 Minuten Färben in einer Lösung von Anilinblau 0,5 g; Orange G 2 g; Oxalsäure 2 g; dest. Wasser 100 ccm (die längere Zeit haltbare Lösung wird gekocht, abgekühlt und filtriert). 4. Auswaschen in Wasser, Differenzieren in 96%igem Alkohol, abs. Alkohol, Xylol, Kanadabalsam. Resultat: Kollagenes und retiku- läres Bindegewebe scharf dunkelblau, Schleim blau, Ery- throzyten rotorange, quergestreifte Muskulatur leuchtend orange, Neuroglia, Ganglienzellen rotviolett, Chromatin rot bis gelblich bräunlich. Säurefuchsin wird von Alkohol gar nicht, stark aber von Wasser angegriffen (daher Fixierung in Phosphorrnolybdän- säure); Anilin blau verhält sich umgekehrt. 782. Am schönsten gelingen in Sublimat und Zenker fixierte Präparate, doch können auch in Formol, Alkohol, Bouinscher oder Flemmingscher Flüssigkeit fixierte Objekte mit gutem Erfolg nach Mallory gefärbt werden, wenn man die Schnitte vor der Färbung 20 Minuten bis mehrere Stunden in Zen- kersche Flüssigkeit oder in 3% ige Kahumbichromatlösung einstellt, kurz abwäscht und färbt (Mc. Gill. 09). 783. Die Modifikationen von Sabin (bei Mall, American Journ. Bd. 1) Wooley, Loele und Loewenstein sind nach meinen Erfahrungen entbehrlich. Auch die neuere von Mal- 198 Untersuchung des Bindegewebes. §784 — 7 86. lory (05) selbst angegebene Methode (s. auch Coca) hat keine wesentlichen Vorzüge, zumal die Haltbarkeit dieser Farb- lösung geringer zu sein scheint. (5 Minuten Färben in 0,1%- igem v/ässerigen Säurefuchsin, dann für 20 Minuten oder länger gleich in Anilinblau 0,5 g -j- Orange G 2 g -(- 1 % ige wäs- serige Lösung von Phosphormolybdänsäure 100 com. Aus- waschen in 95%igem Alkohol, nicht länger als 2 Minuten, abs. Alkohol, Xylol, Balsam.) 784. Um -die Kerne besser hervorzuheben, empfiehlt Herxheimer mit Lithionkarmin vorzufärben. 785. Modifikation von Heidenhain (15). 1. Kern- färbung. Man bringt die Schnitte, um sie alkalisch zu machen, zunächst in eine Anilin- oder Cinchoninlösung (1 : 1000 Alkohol von 96%). Nach 30 Minuten überträgt man in eine l%ige Aufschwemmung von Azokarmin G (Badische Anilin- und Sodafabrik), wärmt diese % — 1 Stde. im Thermostaten bei 56^ C an, läßt die Schnitte allenfalls noch 1 — 2 Stunden bei 37^ in der Farbe, spült mit Wasser ab und differenziert mit der alkoholischen Anilinlösung, bis die Kerne gut hervortreten. Durch Zusatz von etwas Wasser zur Anilinlösung läßt sich der Vorgang beschleu- nigen. 2. Einstellen der Schnitte zur Beizung und völligen Entfärbung des Bindegewebes in eine 5% ige Phosphor- wolframsäure (% — 3 Stunden), kurzes Abspülen in dest. Wasser. 3. Färben in der Anilinblau-Orange-Oxal- säurelösung von Mallory, die man mit dem gleichen oder doppelten Volumen Wasser verdünnt, 1 — 3 Stunden. Abwaschen in W'asser, ev. Differenzieren in abs. Alkohol, Xylol, Balsam. Die Oxalsäure der Malloryschen Mischung kann auch durch 8% Essigsäure ersetzt werden. 786. Ausgezeichnete Farbdifferenzierung gibt die Me- thode von Pasini. Fixierung in Alkohol, Formol, Sublimat, Zenkerscher oder Orthscher Flüssigkeit u. a. Einbettung in Paraffin oder Zelloidin. Färbung: 1. Übertragen der Schnitte aus Wasser in eine 2% ige Lösung von Phosphor- wolframsäure für 10 Minuten. 2. Kurz Abspülen in dest. Wasser. 3. Färben 15 — 20 Minuten in folgender Mischung: Wasserblau-Orcein nach Unna: 10 Tropfen + 2%ige Eosin-B.-A. -Lösung in 50%igem Alkohol: 12 Tropfen + gesättigte wässerige Säurefuchsinlösung: 1 Tropfen -j- neutrales Glyzerin 5 Tropfen. 4. Wässern in dest. Wasser. 5. Differenzieren in abs. Alkohol. 6. Eintauchen in 2% ige Phosphorwolframsäure (einige Sekunden). 7. Abs. Alkohol. Xylol, Balsam. § 787 — 792. Untersuchung des Bindegewebes. 199 Resultat: Das kollagene Bindegewebe ist scharf blau, das Protoplasma hellblau, Kerne, Epithelfasern, Kerato- byahn rot, Keratin gelbrot gefärbt. Ich habe das Volumen der Tropfen bestimmt und dabei für die oben angegebenen Mengen folgende Zahlen gefunden: Wasserblau-Orcein = 0,3 ccm; Eosin = 0,3 ccm; Säure- fuchsin = 0,04 ccm; Glyzerin = 0,25 ccm. 787. Zur Herstellung der Unnaschen Wasserblau- Oreein- lösung löst man a) 1 g Wasserblau in 100 ccm dest. Wasser und b) 1 g Orcein in 50 ccm abs. Alkohol, setzt hierzu 5 ccm Eisessig und 20 ccm Glyzerin und vereinigt Lösung a und b. 788. Es gibt noch eine zweite Wasserblau- Orcein-Lösung von Unna mit Eosin (s. § 674), die jedoch für die Pasini- Methode nicht zu brauchen ist. 789. Sehr gute Resultate gibt auch die von Heiden- hain (08b) angegebene Färbung mit Pikroblauschwarz, durch die sich, besonders nach Fixierung in Sublimat, Subtrie, Alkohol, Orthscher oder Hellyscher Lösung auch Retikulumfasern, Basalmembranen, intrazellulär gelegene, entstehende Fibrillen, sehr scharf darstellen lassen. Auch die Zellgrenzen werden oft gut sichtbar. Man färbt zuerst in Lithionkarmin, Karmalaun od. dgl. und dann unter Kon- trolle mit dem Mikroskop progressiv in: Blauschwarz Big, konz. wässerige Pikrinsäure 400 ccm ; Methylalkohol 80 ccm, dest. Wasser 320 ccm. Die Farblösung ist unbegrenzt halt- bar; zur Färbung ist es zweckmäßig, sie mit dem gleichen Volumen Wasser zu verdünnen. Resultat: Bindegewebe scharf schwarz gefärbt, Knorpel graublau, Muskel gelblich, Dotter gelb, ebenso Erythrozyten, Kerne rot. 790. Ähnlich wirkt die von Freeborn angegebene Färbung mit Pikro-Nigrosin, welche Schaff er (99) zur Wahrnehmung dünnster Häutchen von der Fläche empfiehlt. Die mit Wasser aufgeklebten Schnitte werden 30 Minuten oder länger in einem Gemisch von 90 ccm gesättigter wässeriger Pikrinsäure- und 10 ccm l^oiger wässeriger Nigrosinlösung gefärbt; so- dann Auswaschen, Alkohol, Xylol, Balsam. Resultat: Binde- gewebe blauschwärzhch, Muskelfasern graugrün (Verdich- tungsknoten leuchtend gelb). 791. Merkel (09) färbt in Eisenhämatoxylin vorgefärbte Bindegewebsschnitte von Zenker oder Müller (ev. mit Formol- zusatz-) Präparaten in Säuregrenat 1 ccm auf 200 ccm Aqua dest. unmittelbar vor Gebrauch zu gleichen Teilen mit kon- zentrierter wässeriger Pikrinsäure gemischt, eine Minute, dann direkt in 96 °o igen, resp. (Paraffinschnitte) abs. Alkohol, durch Origanumöl, resp. Xylol in Balsam. 792. Ferner verwandte Merkel (09) zum gleichen Zwecke Napht holschwarz (l%ig), konz. Pikrinsäure zu gleichen 200 Untersuchung des Bindegewebes. § 793—796, Teilen, dazu 2 — 3 Tropfen konz. Orange- G- Lösung 10 Minuten, abspülen in Wasser, 96%iger oder abs. Alkohol. Origanumöl oder Xylol, Balsam. 793. Nach Hämatoxylinkernfärbung eignet sich zur Darstellung von Bindegewebsfasern besser als Eosin eine konzentrierte Lösung von Chromotrop 2 R in abs. Alkohol. Abspülen in abs. Alkohol, Xylol, Balsam (in Heidenhain 05 d und 08a). 794. Traina (09) gibt folgende Methode an: Schnitte von in Sublimat, Zenkerscher oder Orthscher Lösung fixierten Präparaten kommen für 2 Stunden in frisch hergestellte 2% ige Resorzinlösung. Nach kurzem Abspülen färbt man 10 Minuten in l%iger Acridinrotlösung; sodann Eintau- chen in dest. Wasser und Nachfärben in einer Mischung von 95 ccm gesättigter wässeriger Pikrinsäure und 5 ccm eine l%igen wässerigen Wasserblaulösung. Nach kurzem Ab spülen Entwässern in abs. Alkohol, dann Xylol, Balsam. Re- sultat: Bindegewebe blau. Kerne und Kolloid rot, Muskel und Protoplasma grün. 795. Sehr zahlreich sind die Methoden mit Säure- fuchsin-Pikrinsäure, die besonders als van Giesonsche Fär- bung allgemein üblich sind, obwohl ihr z. B. die Mallorysche an Schärfe und Haltbarkeit w^it überlegen ist. Über die van Giesonsche Färbung und ihre Modifikationen vgl. § 415 ff. 796. Ähnlich ist die Bindegew ebsfärbung von Hansen (98a, 05), zu der man folgende längere Zeit haltbare Stamm- lösung benötigt: 100 ccm gesättigte w^ässerige Pikrinsäurelösung. 5 ccm 2% ige w^ässerige Säurefuchsinlösung. . Will man intensivere Färbung erzielen, so nehme man etwas mehr Säurefuchsin (7,5 — 10 ccm), färbe aber dann kür- zere Zeit (30—60 Sekunden). Vor dem Gebrauche setzt man zu 30 ccm dieser Stamm- lösung 7 Tropfen l%iger Essigsäure hinzu. Man färbt 20 Minuten bis 24 Stunden, tropft ab und bringt in Wasser, welchem man auf 30 ccm 20 Tropfen der zuletzt genannten angesäuerten Farbe zusetzt, für wenige Sekunden, entwässert in 96%igem Alkohol, den man einmal wechselt, 3 Minuten und überträgt in abs. Alkohol, den man ebenfalls erneuert, auf 5 Minuten. Dann kommt Xylol, dicker Kanadabalsam. — Bindegewebsfibrillen rot, alle anderen Bestandteile der Schnitte gelb. Vorfärbung, z. B. mit Hämatoxylin, ist zu- lässig. Pikrinsäure löst sich in starkem Alkohol rascher wie Säurefuchsin. Die Färbung vergeht bald, wenn man Schnitte mit Objektträgern und Deckgläsern aus gewöhn- lichem Glas in Berührung bringt. (Seh äff er 96.) Die Fär- § 797 — 800. Untersuchung des Bindegewebes. 201 bung erhält sich länger, wenn man Objektträger und Deck- gläser aus Glimmer benützt. Vgl. § 415. 797. Schaffer (96, 99) verwendet zur elektiven Binde- gewebsfärbung gesättigte, wässerige Pikrinsäure 100, Patent- Säurerubin 0,15, Eisessig 2 Tropfen. Vorbehandlung Subh- mat oder Alkohol, Färbedauer 1 Minute bis Stunden, wenn mittels Hämatoxylin-Tonerde vorgefärbt wurde; direkt in 95% igen -Alkohol, darin gut ausschwenken. 798. Viel schärfer als in den § 795 bis § 797 ange- führten Methoden werden die kollagenen Fasern (und auch das retikuläre Gewebe) durch die Modifikation der Rib- bertschen Methode von Hueter (11) dargestellt: Schnitte beUebig fixierter Präparate kommen ev. nach Karminvorfärbung 15 — 30 Sekunden in 10% ige Phosphor- wolframsäure, werden flüchtig in Wasser gespült und in Phosphorwolf ramhämatoxylin (s. u.) gefärbt. Hierauf wer- den die Schnitte 10 — 20 Minuten in öfters gewechseltem 50%igem Alkohol gebläut, dann durch abs. Alkohol (10 bis 15 Minuten) in Xylol und Balsam gebracht. Resultat: Gitterfasern leuchtend blau. Herstellung des Phosphorwolframhämatoxylins (von Schue- ninoff): Hämatox. 1,75 g; Acid. carbol. crist. 5 g, 10%ige wässerige Phosphorwolframsäure (Kahlbaum) 10 ccm, dest. Wasser 200 ccm. Die Lösung muß mehrere Monate im Sonnen- licht reifen. 799. Bei der Ribbertschen Modifikation der Häma- toxylinmethode von Mallory kommen behebig fixierte Schnitte i/o Minute in 10% ige wässerige Phosphormolybdän- säurelösung, abspülen mit Wasser, dann in (an der Sonne mehrere Monate) gereifte Lösung: 10% ige Phosphormolybdän- säure 10, Hämatoxin 1,75 g, Ac. carb. crist. 5 g. Aqua dest. 200 für 5 Minuten, waschen in Wasser, Alkohol, Xylol, Kanada- balsam: Kollagene Fasern tief schwarzblau. 800. Methode von Verocay: Aufgeklebte Schnitte be- liebig fixierter Objekte werden (bei Paraffineinbettung nach Entfernung des Paraffins) gründlich gewässert und etwa '10 — 24 Stunden bei 46^ C in 1% iger wässeriger Chrom- säurelösung gebeizt. Die Dauer der Beizung ist je nach Organ und Fixierung verschieden. Hierauf wird nach zwei- maligem Abspülen in Wasser % — 2 Stunden in unver- dünntem Delafieldschen Hämatoxylin gefärbt. Nach kur- zem Auswaschen in Wasser ev. Kontrastfärbung mit Eosin, Aurantia, Orange od. dgl. Alkohol, Xylol, Balsam. Resul- tat: Bindegewebsfasern blauschwarz. Mißerfolge kommen nach Verocay hauptsächlich dadurch zustande, daß man vor der Chromierung nicht genügend gewässert hat; bei 202 Untersuchung des Bindegewebes. § 801 — 803. Zelloidinschnitten auch dadurch, daß man die Objekte auf Material aufgeblockt hat, das vom Alkohol angegriffen wird (z. B. Holzblöckchen). 801. Sehr wertvoll sind die Silbermethode n nach Bielschowsky-Maresch und nach Achucarro-Ranke. Bei ihnen färben sich kollagene Bindegewebsfasern wie be- sonders auch retikuläre Fasern (Gitterfasern) intensiv schwarz bzw. braunschwarz. Beide Methoden liefern außer- ordentlich scharfe Bilder. 802. Methode von Bielschowsky-Maresch. 1. Man fixiert 24 Stunden in 10%iger Formollösung und wäscht in fließendem Wasser ca. 6 Stunden aus. 2. Möglichst dünne Gefrierschnitte (5 — 10 fx) kommen aus dest. Wasser für 24 — 48 Stunden in eine 2% ige Silber- jiitratlösung. 3. Nach raschem Spülen in Wasser kommen die Schnitte für 2 — 30 Minuten in eine frisch zu bereitende ammoniaka- lische Silberlösung (s. u. § 803). 4. Nach Durchziehen durch dest. Wasser werden sie in 20% ige, mit Wasserleitungswasser hergestellte Formol- lösung übertragen, 5 — 30 Minuten (bis keine weißen Wolken mehr abgehen und die Schnitte schiefergrau-schwärzlich sind). 5. Nach kurzem Auswaschen mit Brunnenwasser kom- men die Schnitte in ein Goldbad (etwa 5 Tropfen einer l%igen wässerigen Goldchloridlösung auf 10 ccm dest. Wasser und 2 — .3 Tropfen Eisessig), bis sie eine rotviolette Farbe angenommen haben (10 Minuten bis 1 Stunde). 6. Abspülen in dest. Wasser und Fixieren in 5%iger Natriumthiosulfatlösung (Fixiernatron) % — 1 Minute (nicht länger, da sonst die Imprägnierung an Schärfe verliert). 7. Sehr sorgfältiges Auswaschen in Wasser (mehrere Stunden), Entwässern usw., Balsam. Das Übertragen der Schnitte darf nur mit Glasstäbchen erfolgen. Resultat: Bindegewebsfibrillen und Gitterfasern heben sich tiefschwarz von dem nur leicht gelblich gefärbten üb- rigen Gewebe außerordentlich scharf ab. Breite Binde- gewebsbündel sind meist in mehr braunviolettem Ton ge- färbt. Am besten gelingt die Methode nach Formol- und Alkohol- fixierung. Bei Objekten, die mit Chromsalzen fixiert wurden, erlebt man häufig Mißerfolge. 803. Herstellung der ammoniakalischen Silberlösung: Man setzt zu 10 ccm einer 10% igen Silbernitratlösung I § 804 — 807. Untersuchung des Bindegewebes. 203 5 Tropfen reinster 40%iger Natronlauge, wobei sich ein schwarzbrauner Niederschlag von Silberoxyd bildet. Hier- auf wird unter stetem Umschütteln der Silberlösung, die man am besten in einem kleinen Erlenmeyerschen Kölb- chen hat, tropfenweise solange Ammoniak zugesetzt, bis der Niederschlag bis auf ein paar Körnchen gelöst ist. Dann füllt man mit dest. Wasser auf 20 ccm auf. Ein Überschuß an Ammoniak ist peinlich zu vermeiden. Die Lösung enthält ammoniakalisches Silberoxyd und -nitrat. 804. Schlemmer wäscht den Silberoxydniederschlag aus, indem er ihn absitzen läßt, die darüberstehende Flüssigkeit abgießt, wieder mit dest. Wasser auffüllt und dieses solange wiederholt, bis das Waschwasser nicht mehr alkahsch reagiert. Zuletzt löst er den Niederschlag in möghchst wenig Ammo- niak und verdünnt vor Gebrauch mit 10 Teilen Wasser. Weitere Modifikationen s. § 807, 4; 984 u. 987. 805. Anwendung der Bielschowsky-Methode auf Paraffinschnitte von formolfixiertem Material. In die- sem Falle läßt man die Schnitte vor der Paraffinentfernung auf den einzelnen Lösungen schwimmen, fischt sie zuletzt mit reinen Objektträgern heraus und behandelt sie wie mit Wasser aufgeklebte Schnitte weiter. Man erwärmt die Lö- sungen am besten auf 35^ C und verlängert die Zeitdauer, also: 2% ige Silbernitratlösung, 24 — 48 Stunden, ammo- niakalische Silberlösung mindestens Vo Stunde. Ebenso lange Reduktion in Formol; Goldchloridlösung (l%ig) 1 Stunde, Fixiernatron (5% ig) 2 Minuten Ganz ähnlich imprägniert man aufgeklebte Paraffin- schnitte nach Paraffinbefreiung. 806. Stückimprägnierung. Dazu überträgt Bielschowsky in einer neueren Methode die nicht zu großen formolfixierten Stücke nach kurzem Auswässern für 3 — 4 Tage in reines Pyridin (Merck). Nach mehrstündigem Auswaschen in mehr- fach erneuertem dest. Wasser (bis Pyridingeruch verschwun- den) imprägniert man in 3%iger ÄgNOg -Lösung bei 37" 3 — 5 Tage. Dann kurzes Auswaschen in dest. Wasser und Einlegen in die in § 803 angegebene Silberlösung, die man auf das Fünffache mit dest. Wasser verdünnt und mit einigen Tropfen Ammoniak versetzt. Nach 24 Stunden wässert man 2 Stunden in mehrfach erneuertem dest. Wasser, reduziert in 20% Formol, entwässert in steigendem Alkohol und bettet in Paraffin ein. Die Vergoldung erfolgt am Schnitt. 807. Besser verfährt man nach den Vor- schriften Agduhrs, bei deren genauer Befolgung man sehr schöne Resultate erzielt: i. Fixierung in schwach saurem (nicht alkalischem) Formalin (1 Teil For- 204 Untersuchung des Bindegewebes. § 807. malin + 1 Teil Wasser, also 50% ige Formalinlösung= 20%- iger Formaldehydlösung); am besten fixiert man durch Injektion des tief narkotisierten Tieres vom Herzen aus (linke Kammer; zuerst Durchspülen mit warmer physio- logischer Kochsalzlösung 12 cm hoher Druck). Dauer: 5 Tage. 2. Hierauf wird zur Entfernung des reduzierenden Formols und anderer reduzierender Substanzen sehr sorg- fältig in dest. Wasser ausgewaschen. In den meisten Fällen genügt es, die in 1 — 3 ccm große Würfel zerlegten Organ- teile 7 Tage lang in dest. Wasser, das täglich 1 — 2 mal er- neuert wird, auszuwaschen (durch das Auswaschen wird unter anderem auch die bei Befolgung der Bielschowsky- schen Vorschrift auftretende Krustenbildung vermieden). 3. Übertragen in das 3 — 4 fache Volumen einer 3% igen Silbernitratlösung auf 6 Tage (im Dunkeln bei Zimmer- temperatur). 4. Abspülen in wiederholt erneuertem dest. Wasser und Einlegen in die ammoniakalische Silberlösung, welche folgendermaßen hergestellt wird: Zu 10 ccm einer 10% igen AgNOg-Lösung setzt man unter Umrühren 20 Tropfen einer 25% igen Natronlauge (Gewichtsprozent; 1 Tropfen = 0,096 ccm). Dann verdünnt man mit 200 ccm dest. Wasser und setzt tropfenweise unter fleißigem Umrühren solange Ammoniak zu, bis der Niederschlag bis auf einen geringen Rest gelöst ist. In diese Lösung kommen die Blöcke für 20 Stunden. (Das Volumen der Flüssigkeit soll das 8 — 9 fache der Organe betragen.) 5. Dann 1 Stunde in reines dest. Wasser. (Will man dagegen nur die Nerven darstellen, dann bringt man die Stücke vorher in dest. Wasser, dem auf 100 ccm 10 Tropfen Eisessig (1 Tropfen = 0,2 ccm) zugesetzt werden, Dauer 1 Stunde; nach % Stunde erneuern. Unter Umständen muß man den Eisessigzusatz und die Dauer der Einwir- kung erhöhen, z. B. bis zu 50 Tropfen und 18 Stunden. Hier ist jedoch Vorsicht nötig, da sonst die feinen Äste mit den Endigungen unsichtbar werden; vgl. auch § 986.) 6. Übertragen in 20% ige neutrale oder schwach alka- lische Formaldehydlösung (s. o.). Das Neutralisieren erfolgt mit Na OH. Indikator: Lackmuspapier. Verdünnen des For- malins mit Brunnenwasser. Für jeden Block 100 ccm der Lösung. Dauer 4 Tage. Nach dem 1. Tag wird erneuert. 7. Einbettung in Paraffin in gewöhnlicher Weise. Die Vergoldung und Fixierung erfolgt am Schnitt. § 808 — 810. Untersuchung des Bindegewebes. 205 808. Sehr wichtig ist auch die Tannin- Silber-Methode von Achücarro. 1. Fixierung in 10%iger Formollösung (nicht über 1 Jahr). Gefrierschnitte von 10 — 20 fjL. Kurzes Auswaschen in dest. Wasser. (Man kann auch Paraffin- oder Zelloidinschnitte von an- ders fixiertem Material verwenden; unbrauchbar sind jedoch Fixierungsflüssigkeiten, die Metallsalze (besonders Chromate) enthalten.) 2. Erwärmen der Schnitte in kalt gesättigter Tannin- lösung, 15 Minuten oder länger bei 50^ C. Man nimmt am besten das zu 50% in Wasser lösliche Acid. tannic. leviss. puriss. Merck D. A. V. (das schwerer lösliche Tannin D. A. IV ist unbrauchbar). 3. Nach dem Erkalten Auswaschen jedes einzelnen Schnittes in dest. Wasser, bis er durch Abgabe des freien Tannins wieder undurchsichtig geworden ist, und Über- führen in 20 ccm dest. Wasser, dem 8 — 12 Tropfen der ammoniakalischen Silberlösung nach Bielschowsky (siehe § 803) zugefügt sind. Hier wird der Schnitt mit einer Glasnadel so lange hin- und herbewegt, bis er unter Abgabe von brauner Farbe gebräunt ist. Der Grad der notwen- digen Bräunung ist für verschiedene Organe verschieden. 4. Direktes Übertragen in 10% ige Formollösung (Ranke, Achücarro wäscht dazwischen kurz in dest. Wasser aus). 5. Auswaschen ev. Kern- oder Protoplasmafärbung (besonders mit Eosin, Methylenazur), steigender Alkohol, Xylol, Balsam. Bei richtiger Technik erscheinen an solchen Präparaten auch die feinsten Fasern scharf schwarzbraun gefärbt. 809. Nach Ranke ist es gut, die Schnitte vor der Färbung einige Zeit (ca. 8 Tage) in 80% igen Alkohol zu legen, der einige Korkstücke enthält. Hierauf werden sie in Brunnen- wasser . abgespült, 8 — 12 Stunden oder länger in 10%iges Formol eingelegt, kurz gewässert und nach § 808 weiter be- - handelt. 810. Empfehlenswert ist die Modifikation von Klarfeld. 1. 10 — 15 [x dicke Zelloidinschnitte kommen zunächst 24 Stunden in 10%iges Formol. 2. Nach Ab- spülen in Wasser werden sie 20 — 30 Minuten in einer kalt- gesättigten Tanninlösung (Ac. tann. puriss. leviss. Merck) über der Spiritusflamme erhitzt oder 2 — 3 Stunden bei 50^ C gehalten. 3. Nach Erkalten der Lösung werden die Schnitte so lange mit dest. Wasser gewaschen, bis sie un- 206 Untersuchung des Bindegewebes. § 811 — 813. durchsichtig sind. 4. Einlegen in die folgendermaßen be- reitete ammoniakalische Silberlösung: Zu 5 com einer 10% igen Silbernitratlösung wird tropfenweise Ammoniak zugesetzt, bis der gebildete Niederschlag wieder gelöst ist. Hierauf ward noch ein Überschuß von 5 — 10 Tropfen Am- moniak zugefügt (wichtig!) und mit dest. Wasser auf 20 ccm aufgefüllt. Von dieser Lösung werden 15 Tropfen auf 20 ccm dest, Wasser vermischt und darin die Schnitte mit einem Glasstäbchen so lange ständig hin- und her- bewegt, bis sie bräunlichgelb sind. Am besten nimmt man dazu zwei Schalen. Die Schnitte dürfen nicht zu braun werden. 5. Direktes Übertragen in 10%iges Formol für 5 Minuten, wobei die Schnitte dunkelbraun-schwarz wer- den. 6. Auswaschen in fließendem Wasser, zuletzt in dest. Wasser. 7. Differenzieren der Schnitte in: 0,5%igem wässe- rigem Ferrozyankalium 100 ccm -\- 96%iger Alkohol 50 ccm. 8. Halbstündiges Auswaschen in dest. Wasser. 9. Alkohol, Xylol, Balsam. (Nach Spielmeyer 14). 811. Recht gute Resultate lassen sich auch mit einer von Krause (11) angegebenen Goldchlorid- Jodjodkalium- Methode erzielen, die an Schnitten von frischem wie von konserviertem Material ausgeführt werden kann. Die Schnitte kommen für 30 Minuten in Jodjodkalilösung (1 : 2 : 300), die zur Hälfte mit Wasser verdünnt wird. Die stark rotbraun gefärbten Schnitte werden in Wasser kurz abgespült und für 30 Minuten in 0,2%iges Gold- chlorid gelegt, in dem sie nach anfänglicher Entfärbung gelb werden. Nach gründlichem Abspülen wird 1 — 2 Stun- den lang in einer 2% igen Resorzinlösung reduziert. Dann Abspülen und Übertragen in 5% ige Natriumthiosulfat- lösung. Nach 15 — 30 Minuten gründhches Wässern usw. 812. Um Bindegewebsfibrillen und Plastosomen gleich- zeitig darzustellen, fixiert Frederikse (17) nach Altmann oder Benda, färbt dann mit Anilinwasser- Säurefuchsin und differenziert mit alkoh. Piki^insäure (vgl. § 555). Hierauf färbt man mit einer Mischung von 9 Teilen gesättigter alkoh. Pikrinsäurelösung und 1 Teil einer Lösung von Naphtholschwarz B (1 g auf 80 ccm Wasser und 20 ccm Gly- zerin). Resultat: Plastosomen rot, Bindegewebsfibrillen blau. 813. Sehr schwierig ist meist die Bearbeitung von Sehnengewebe. M. Heidenhain (13) trocknet für Kurszwecke die Sehnen, fertigt Rasiermesserschnitte an und färbt die in Wasser gebrachten wieder aufquellenden Schnitte mit Rutheniumrot. § 814—816. Untersuchung des Bindegewebes. 207 b) Färbung des elastischen Gewebes. 814. Die beste Färbemethode elastischer Fasern ist die mit ßesorzin-Fuchsin nach Weigert. Sie gehngt nach allen üblichen Fixierungen. Herstellung der Farblösung: In 200 ccm einer l%igen wässerigen Fuchsinlösung (nicht Fuchsin Sl!) wer- den 4 g Resorzin- gelöst. Die Lösung wird in einer Porzellan- schale zum Kochen gebracht, dann setzt man 25 ccm Liquor ferri sesquichlorati (D. A. III spez. Gew. 1,1; s. a. § 364) zu und kocht unter Umrühren noch 2 — 5 Minuten weiter. Nach Erkalten wird filtriert. Der dabei erhaltene Niederschlag wird mit dem Filter in die vorher benützte Porzellanschale ge- bracht, um den in der Schale allenfalls noch zurückgeblie- benen Niederschlag ebenfalls noch mit zu verwenden. Das Ganze wird dann unter stetem Umrühren nach Zusatz von 200 ccm 95% igen Alkohols gekocht, Wobei man das Filtrier- papier stückweise entfernt. Nach Erkalten filtriert man, füllt das Filtrat mit 95%igem Alkohol auf 200 ccm auf und setzt 4 ccm Salzsäure hinzu. Bei dieser Behandlung des Fuchsins entsteht nach Weigert ein neuer Farbstoff, der in Alkohol löslich, in Wasser dagegen unlöslich ist. Der Farbstoff ist als Resorzin-Fuchsin oder Kresofuchsin bei Grübler auch in Trockensubstanz käufhch. Man löst zum Gebrauch 4 — 5 g desselben in 200 ccm 96%igem Alkohol und setzt 4 ccm Salzsäure zu. Die Lösung bewahrt ihre volle Färbekraft nur 4 bis 5 Wochen. Zur Färbung werden die Schnitte 20 bis 60 Minuten in die Farblösung gestellt und dann solange in 95%igem Alkohol belassen, bis die elastischen Fasern dunkelblau, fast schwarz auf grauem, beinahe farblosem Grunde erscheinen. Die Kerne sind ungefärbt; zweckmäßig färbt man sie vorher mit Karmin. Zuletzt abs. Alkohol, Xylol, Balsam (nicht Karbolxylol). 815. Man kann die Präparate auch mehrere Stunden in der Farbe lassen, muß aber mindestens ebensolange mit 96%igem Alkohol auswaschen. Bei starker Überfärbung differenziert man mit Salzsäure-Alko